| 摘要 | 第1-12页 |
| Abstract | 第12-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-33页 |
| 1 猪流行性腹泻与猪传染性胃肠炎研究进展 | 第17-30页 |
| ·PEDV概述 | 第17-23页 |
| ·PEDV病原学特性 | 第17-18页 |
| ·病毒基因组结构与复制 | 第18-19页 |
| ·PEDV主要编码的结构蛋白及功能 | 第19-21页 |
| ·PEDV流行病学与致病机理 | 第21页 |
| ·常规疫苗研究进展 | 第21-22页 |
| ·基因工程疫苗研究进展 | 第22-23页 |
| ·TGEV概述 | 第23-30页 |
| ·TGEV病原学特征 | 第23-24页 |
| ·TGEV的流行特点与致病机理 | 第24-25页 |
| ·TGEV基因组结构复制与表达 | 第25-26页 |
| ·TGEV结构蛋白与功能 | 第26-28页 |
| ·TGEV常规疫苗研究现状 | 第28页 |
| ·基因工程疫苗 | 第28-30页 |
| 2 减毒沙门氏菌研究进展 | 第30-33页 |
| ·沙门氏菌的减毒原理 | 第30-31页 |
| ·减毒沙门氏菌入侵途径 | 第31页 |
| ·减毒沙门氏菌传递疫苗的免疫应答机制 | 第31-32页 |
| ·减毒沙门氏菌作为DNA疫苗载体的优点 | 第32页 |
| ·减毒沙门氏菌在疫苗研究中的应用 | 第32-33页 |
| 第二章 猪流行性腹泻病毒的分离鉴定 | 第33-56页 |
| 1 材料 | 第33-35页 |
| ·病料来源 | 第33页 |
| ·细胞、载体及菌株 | 第33-34页 |
| ·主要试剂 | 第34页 |
| ·试剂配制 | 第34-35页 |
| ·主要仪器设备 | 第35页 |
| 2 方法 | 第35-42页 |
| ·腹泻病料的采集与处理 | 第35页 |
| ·病毒的分离 | 第35页 |
| ·病毒TCID_(50)的测定 | 第35-36页 |
| ·病毒电镜观察 | 第36页 |
| ·病毒核酸类型鉴定 | 第36页 |
| ·病毒的理化特性试验 | 第36-37页 |
| ·氯仿敏感试验 | 第36-37页 |
| ·耐热试验 | 第37页 |
| ·耐酸试验 | 第37页 |
| ·RT-PCR扩增 | 第37-39页 |
| ·引物的设计 | 第37页 |
| ·病毒增殖 | 第37-38页 |
| ·病毒RNA的提取与cDNA的合成 | 第38-39页 |
| ·S基因PCR扩增 | 第39页 |
| ·扩增产物的克隆与序列测定 | 第39-42页 |
| ·PCR产物胶回收 | 第39-40页 |
| ·目的基因与T载体连接 | 第40页 |
| ·DH5α感受态细胞制备 | 第40页 |
| ·连接产物转化DH5α感受态细胞 | 第40-41页 |
| ·重组质粒质粒的PCR鉴定 | 第41-42页 |
| ·目的基因核苷酸序列测序与分析 | 第42页 |
| 3 结果与分析 | 第42-53页 |
| ·病毒分离与传代 | 第42-43页 |
| ·病毒TCID_(50)测定结果 | 第43-44页 |
| ·电镜观察病毒形态 | 第44-45页 |
| ·病毒核酸类型鉴定结果 | 第45-46页 |
| ·病毒理化特性试验结果 | 第46-48页 |
| ·氯仿敏感性试验 | 第46页 |
| ·耐酸性试验 | 第46-47页 |
| ·耐热性试验 | 第47-48页 |
| ·RT-PCR扩增结果 | 第48-49页 |
| ·PEDV S基因序列测定 | 第49-51页 |
| ·PEDV S基因核苷酸序列 | 第49-50页 |
| ·PEDV S基因推导氨基酸序列 | 第50-51页 |
| ·核苷酸序列及氨基酸序列同源性与进化树分析结果 | 第51-53页 |
| ·PEDV S蛋白N端的亲水性、表面性与抗原性预测分析 | 第53页 |
| 4 讨论 | 第53-55页 |
| ·病毒的分离鉴定 | 第53-54页 |
| ·病毒S基因部分序列分析 | 第54-55页 |
| 5 小结 | 第55-56页 |
| 第三章 PEDV S基因主要抗原区域基因片段的原核表达及生物活性研究 | 第56-72页 |
| 1 材料 | 第56-58页 |
| ·菌株和质粒 | 第56页 |
| ·主要生物试剂 | 第56页 |
| ·主要溶液配制 | 第56-58页 |
| ·实验仪器 | 第58页 |
| 2 方法 | 第58-64页 |
| ·猪流行性病毒S1基因主要抗原区片段的原核表达载体构建 | 第58-60页 |
| ·PEDV Sa基因的PCR扩增 | 第58-59页 |
| ·PEDV Sa基因片段的克隆 | 第59页 |
| ·Sa基因T-A克隆质粒PCR鉴定 | 第59-60页 |
| ·Sa基因T-A克隆质粒的酶切鉴定 | 第60页 |
| ·Sa蛋白原核表达质粒的构建 | 第60页 |
| ·连接产物转化DH5α感受态细胞 | 第60页 |
| ·PEDV Sa蛋白基因重组表达质粒的诱导表达 | 第60-62页 |
| ·重组质粒pET32a-Sa转化BL21感受态细胞 | 第60-61页 |
| ·SDS-PAGE电泳方法 | 第61页 |
| ·PEDV Sa重组成熟蛋白的培养和诱导 | 第61-62页 |
| ·IPTG诱导表达时间的优化 | 第62页 |
| ·IPTG诱导表达浓度的优化 | 第62页 |
| ·PEDV Sa重组成熟蛋白的大量表达及纯化 | 第62-64页 |
| ·重组蛋白的大量表达 | 第62-63页 |
| ·重组蛋白的初步洗涤纯化 | 第63页 |
| ·重组蛋白的亲和层析纯化 | 第63-64页 |
| ·重组蛋白高免血清的制备及Western-blot鉴定 | 第64页 |
| ·制备融合蛋白高免血清 | 第64页 |
| ·重组蛋白的Western-blot鉴定 | 第64页 |
| 3. 结果 | 第64-69页 |
| ·PEDV Sa基因的扩增 | 第64-65页 |
| ·PEDV Sa原核表达质粒的构建 | 第65-66页 |
| ·PEDV Sa重组蛋白SDS-PAGE鉴定 | 第66页 |
| ·PEDV Sa重组蛋白原核表达条件优化 | 第66-68页 |
| ·PEDV Sa重组蛋白诱导表达IPTG浓度的优化 | 第66-67页 |
| ·对PEDV Sa重组蛋白诱导表达时间优化 | 第67-68页 |
| ·PEDV Sa重组融合蛋白的Western-blot鉴定 | 第68-69页 |
| 4. 讨论 | 第69-71页 |
| ·关于PEDV Sa基因原核表达 | 第69-70页 |
| ·PEDV Sa重组蛋白表达条件优化 | 第70页 |
| ·PEDV Sa蛋白纯化 | 第70-71页 |
| 5 小结 | 第71-72页 |
| 第四章 PEDV和TGEV双基因共表达真核质粒的构建 | 第72-88页 |
| 1. 材料 | 第72-73页 |
| ·毒株、菌株、质粒和细胞 | 第72页 |
| ·主要试剂 | 第72-73页 |
| ·主要试剂配制 | 第73页 |
| ·主要仪器设备 | 第73页 |
| 2 方法 | 第73-79页 |
| ·引物设计 | 第73-74页 |
| ·PEDV与TGEV的增殖与收获 | 第74页 |
| ·病毒RNA的提取 | 第74页 |
| ·PEDV S1基因与TGEV S基因的RT-PCR扩增 | 第74-75页 |
| ·PEDV S1基因与TGEV S基因cDNA的合成 | 第74-75页 |
| ·PCR扩增PEDV S1基因与TGEV S基因 | 第75页 |
| ·PEDV S1基因与TGEV S基因的T-A克隆 | 第75-76页 |
| ·PEDV S1基因与TGEV S基因PCR产物胶回收 | 第75页 |
| ·PEDV S1基因与TGEV S基因与T载体的连接 | 第75-76页 |
| ·连接产物转化感受态细胞 | 第76页 |
| ·PEDV S1基因与TGEV S基因T-A克隆质粒的鉴定 | 第76页 |
| ·PEDV S1基因与TGEV S基因重组质粒小量提取 | 第76页 |
| ·PEDV S1基因与TGEV S基因重组质粒酶切鉴定 | 第76页 |
| ·PEDV S1和TGEV S基因真核表达载体的构建 | 第76-77页 |
| ·PEDV S1基因与TGEV S基因的获取与表达载体的酶切 | 第76-77页 |
| ·PEDV S1基因与TGEV S基因与真核表达载体的连接 | 第77页 |
| ·PEDV S1基因与TGEV S基因真核表达质粒的鉴定 | 第77页 |
| ·PEDV S1和TGEV S双基因共表达质粒pVAXD-PS1-TS的构建 | 第77-78页 |
| ·TGEV S基因的获取与pVAXD-PS1重组质粒的酶切 | 第77页 |
| ·TGEV S基因与酶切后的pVAXD-PS1重组质粒连接 | 第77-78页 |
| ·pVAXD-PS1-TS双基因共表达真核质粒的鉴定 | 第78页 |
| ·PEDV S1基因与TGEV S基因真核表达质粒的体外表达 | 第78-79页 |
| ·制备转染用质粒 | 第78页 |
| ·转染COS-7细胞 | 第78-79页 |
| ·间接免疫荧光检测 | 第79页 |
| 3 结果 | 第79-85页 |
| ·PEDV S1基因与TGEV S基因的RT-PCR扩增 | 第79-80页 |
| ·PEDV S1基因与TGEV S基因T-A克隆质粒的酶切鉴定 | 第80-81页 |
| ·PEDV S1基因与TGEV S基因真核表达质粒鉴定结果 | 第81-83页 |
| ·真核表达质粒表达检测结果 | 第83-85页 |
| 4 讨论 | 第85-86页 |
| ·目的基因的选择 | 第85-86页 |
| ·真核表达载体的选择 | 第86页 |
| 5 小结 | 第86-88页 |
| 第五章 减毒沙门氏菌携带PEDV S1和TGEV S双基因DNA疫苗口服免疫的研究 | 第88-113页 |
| 1. 材料 | 第89-90页 |
| ·菌株、质粒 | 第89页 |
| ·主要试剂 | 第89页 |
| ·主要仪器设备 | 第89-90页 |
| 2 方法 | 第90-95页 |
| ·携带PEDV和TGEV双基因DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建 | 第90-91页 |
| ·SL7207感受态细胞的制备 | 第90页 |
| ·电转化沙门氏菌SL7207 | 第90-91页 |
| ·重组减毒沙门氏菌的鉴定 | 第91页 |
| ·重组减毒沙门氏菌体外稳定性试验 | 第91页 |
| ·重组沙门氏菌对小鼠的安全性试验 | 第91-92页 |
| ·重组减毒沙门氏菌的生长曲线 | 第92页 |
| ·RT-PCR检测基因的转录 | 第92页 |
| ·重组沙门氏菌对小鼠的免疫原性试验 | 第92-94页 |
| ·试验小鼠的免疫程序 | 第92-93页 |
| ·小鼠血清及肠道样品的制备 | 第93页 |
| ·免疫小鼠特异性PEDV和TGEV血清IgG和肠道IgA抗体检测 | 第93-94页 |
| ·减毒沙门氏菌特异性血清IgG和肠道IgA检测 | 第94页 |
| ·免疫小鼠的脾细胞制备及γ-干扰素检测 | 第94-95页 |
| ·免疫小鼠脾细胞的制备 | 第94-95页 |
| ·免疫小鼠γ-干扰素的检测 | 第95页 |
| 3 结果 | 第95-108页 |
| ·携带真核表达质粒的重组减毒沙门氏菌鉴定结果 | 第95-96页 |
| ·RT-PCR检测PEDV和TGEV S基因在体内的转录 | 第96-98页 |
| ·重组减毒沙门氏菌的生长曲线 | 第98页 |
| ·重组减毒沙门氏菌的稳定性试验结果 | 第98-99页 |
| ·重组减毒沙门氏菌感染小鼠的安全性试验 | 第99页 |
| ·PEDV血清IgG抗体的间接ELISA检测结果 | 第99-101页 |
| ·PEDV肠道黏膜IgA抗体的间接ELISA检测结果 | 第101-102页 |
| ·TGEV血清IgG抗体的间接ELISA检测结果 | 第102-103页 |
| ·TGEV肠道黏膜IgA抗体的间接ELISA检测结果 | 第103-104页 |
| ·减毒沙门氏菌特异性肠道IgA检测 | 第104-105页 |
| ·减毒沙门氏菌特异性肠道IgG检测 | 第105-106页 |
| ·免疫小鼠γ-干扰素的检测结果 | 第106-108页 |
| 4 讨论 | 第108-112页 |
| 5 小结 | 第112-113页 |
| 全文结论 | 第113-114页 |
| 本研究的创新点 | 第114-115页 |
| 参考文献 | 第115-129页 |
| 致谢 | 第129-130页 |
| 附件材料 | 第130-131页 |
| 个人简介 | 第131页 |
| 攻读博士期间发表学术论文 | 第131页 |
