胡萝卜抗冻蛋白基因的克隆、原核表达及其遗传转化甘蔗初步研究
| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 一 前言 | 第11-22页 |
| 1 冻害对甘蔗造成的损失 | 第11-12页 |
| ·影响当造甘蔗产量 | 第11页 |
| ·影响原料蔗品质 | 第11页 |
| ·影响种苗的发株数和长势 | 第11页 |
| ·影响宿根甘蔗发株 | 第11-12页 |
| 2 抗冻蛋白 | 第12-21页 |
| ·抗冻蛋白的种类和结构 | 第12-17页 |
| ·鱼类中的抗冻蛋白 | 第12-15页 |
| ·抗冻糖蛋白 | 第13页 |
| ·Ⅰ型抗冻蛋白 | 第13-14页 |
| ·Ⅱ型抗冻蛋白 | 第14页 |
| ·Ⅲ型抗冻蛋白 | 第14页 |
| ·Ⅳ型抗冻蛋白 | 第14-15页 |
| ·昆虫抗冻蛋白 | 第15页 |
| ·植物抗冻蛋白 | 第15-17页 |
| ·抗冻蛋白的特性 | 第17-18页 |
| ·抗冻蛋白具有热滞效应 | 第17页 |
| ·抗冻蛋白能够抑制冰晶的重结晶 | 第17页 |
| ·抗冻蛋白对冰晶形态的作用 | 第17-18页 |
| ·抗冻蛋白的作用机制 | 第18-19页 |
| ·"偶极子-偶极子"假说模型 | 第18-19页 |
| ·氢原子结合模型 | 第19页 |
| ·刚体能量学说 | 第19页 |
| ·抗冻蛋白的应用研究 | 第19-20页 |
| ·在农业上的作用 | 第19页 |
| ·在食品科学上的应用 | 第19-20页 |
| ·在工业上的应用 | 第20页 |
| ·在医学上的应用 | 第20页 |
| ·抗冻蛋白的基因工程研究进展 | 第20-21页 |
| 3.本研究的目的和意义 | 第21-22页 |
| 二 材料与方法 | 第22-37页 |
| 1.实验材料 | 第22-23页 |
| ·植物材料 | 第22页 |
| ·工具酶和试剂 | 第22页 |
| ·主要仪器 | 第22-23页 |
| 2 实验方法 | 第23-37页 |
| ·胡萝卜抗冻蛋白基因的克隆 | 第23-27页 |
| ·胡萝卜基因组DNA的提取 | 第23页 |
| ·目的片段的获得 | 第23-24页 |
| ·目的片段的回收 | 第24页 |
| ·目的片段与载体连接 | 第24页 |
| ·大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备与转化 | 第24-25页 |
| ·鉴定阳性克隆 | 第25-27页 |
| ·目的片段测序 | 第27页 |
| ·胡萝卜抗冻蛋白(AFP)基因的原核表达 | 第27-29页 |
| ·AFP基因的分子鉴定及回收 | 第27-28页 |
| ·原核表达载体质粒的提取、酶切及回收 | 第28页 |
| ·目的片段与表达载体的连接 | 第28页 |
| ·转化大肠杆菌DH5a | 第28-29页 |
| ·原核表达载体拟重组质粒的鉴定 | 第29页 |
| ·pGEX-4T-3-AFP基因的原核表达 | 第29页 |
| ·大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备 | 第29页 |
| ·转化大肠杆菌BL21(DE3) | 第29页 |
| ·表达目的蛋白检测 | 第29-31页 |
| ·目的蛋白的诱导表达 | 第29页 |
| ·表达菌的裂解 | 第29页 |
| ·SDS-PAGE凝胶电泳 | 第29-30页 |
| ·考马斯亮蓝染色 | 第30-31页 |
| ·胡萝卜抗冻蛋白基因的真核表达载体构建 | 第31-32页 |
| ·真核表达载体的构建 | 第31-32页 |
| ·真核表达载体质粒的提取、酶切及回收 | 第32页 |
| ·目的片段与表达载体的连接 | 第32页 |
| ·真核表达载体拟重组质粒的鉴定 | 第32页 |
| ·基因枪转导法将AFP基因转化甘蔗 | 第32-35页 |
| ·质粒DNA的大量提取、纯化与鉴定 | 第32-34页 |
| ·转化材料的轰击 | 第34-35页 |
| ·受体材料的预处理 | 第34页 |
| ·仪器部件的灭菌 | 第34页 |
| ·微弹的制备 | 第34页 |
| ·微弹涂膜 | 第34-35页 |
| ·基因枪轰击 | 第35页 |
| ·愈伤组织的筛选和抗性植株的再生 | 第35页 |
| ·过渡培养 | 第35页 |
| ·继代筛选培养 | 第35页 |
| ·分化筛选培养 | 第35页 |
| ·基因枪轰击后的甘蔗再生体系建立 | 第35-37页 |
| ·愈伤组织的诱导 | 第36页 |
| ·愈伤组织的继代 | 第36页 |
| ·基因枪轰击 | 第36页 |
| ·试验设计 | 第36-37页 |
| 三 结果与分析 | 第37-49页 |
| ·胡萝卜抗冻蛋白基因的克隆与回收 | 第37-38页 |
| ·连接和转化 | 第38页 |
| ·胡萝卜抗冻蛋白基因序列分析 | 第38-39页 |
| ·胡萝卜抗冻蛋白基因的原核表达 | 第39-43页 |
| ·原核表达载体的构建和验证 | 第39-41页 |
| ·目的蛋白的诱导表达 | 第41页 |
| ·信号肽对蛋白表达量的影响 | 第41-43页 |
| ·胡萝卜抗冻蛋白基因转化甘蔗研究 | 第43-45页 |
| ·真核表达载体的构建和验证 | 第43-45页 |
| ·基因枪轰击后的甘蔗再生体系建立 | 第45-49页 |
| ·各因素对分化效果的影响 | 第45-49页 |
| ·各因素对试验效果影响的主次 | 第45-46页 |
| ·各因素对试验效果的影响 | 第46-47页 |
| ·6-BA浓度对分化的影响 | 第46-47页 |
| ·KT浓度对分化的影响 | 第47页 |
| ·NAA浓度对分化的影响 | 第47页 |
| ·蔗糖浓度对分化的影响 | 第47页 |
| ·获得优化组合 | 第47页 |
| ·基因枪轰击对愈伤组织分化的影响 | 第47-48页 |
| ·优化组合与原有再生体系的比较 | 第48-49页 |
| ·组合1与对照生根效果比较 | 第49页 |
| 四 讨论 | 第49-51页 |
| ·关于所克隆的胡萝卜抗冻蛋白基因分析 | 第49-50页 |
| ·关于基因枪轰击对甘蔗愈伤组织的伤害作用 | 第50-51页 |
| ·关于研究的后续工作 | 第51页 |
| 五 结论 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-57页 |
| 附录Ⅰ | 第57-58页 |
| 附录Ⅱ | 第58-59页 |
| 致谢 | 第59页 |
