| 摘要 | 第3-4页 |
| abstract | 第4-5页 |
| 第1章 文献综述 | 第9-21页 |
| 1.1 引言 | 第9-10页 |
| 1.1.1 乳酸乳球菌介绍 | 第9页 |
| 1.1.2 细菌细胞壁介绍 | 第9-10页 |
| 1.2 细胞壁肽聚糖生物合成过程 | 第10-11页 |
| 1.3 细菌中调控细胞壁生长的机制 | 第11-17页 |
| 1.3.1 支架蛋白对细胞壁的调控作用 | 第12-14页 |
| 1.3.2 转录调节因子调控细胞壁合成基因的转录水平 | 第14-15页 |
| 1.3.3 sRNA从转录后修饰水平调控细胞壁 | 第15-16页 |
| 1.3.4 蛋白相互作用影响细胞壁合成与水解 | 第16-17页 |
| 1.4 转录调控因子的研究进展 | 第17-19页 |
| 1.4.1 转录调控因子CodY的调控机制研究 | 第17-18页 |
| 1.4.2 利用定点突变方法研究转录调节蛋白作用的关键氨基酸 | 第18-19页 |
| 1.5 本文的主要研究内容与实验设计 | 第19-21页 |
| 第2章 细胞壁合成基因与CodY转录因子结合的研究 | 第21-41页 |
| 2.1 引言 | 第21页 |
| 2.2 实验材料 | 第21-25页 |
| 2.2.1 实验所用培养基和菌株 | 第21-22页 |
| 2.2.2 实验主要药品 | 第22-23页 |
| 2.2.3 实验试剂与耗材 | 第23-24页 |
| 2.2.4 实验仪器与设备 | 第24-25页 |
| 2.3 实验方法 | 第25-32页 |
| 2.3.1 乳酸乳球菌F44 基因组的提取 | 第25页 |
| 2.3.2 细胞壁合成基因启动子区域引物的设计 | 第25-26页 |
| 2.3.3 目的片段的扩增和产物的纯化 | 第26-27页 |
| 2.3.4 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第27-29页 |
| 2.3.5 全局转录因子CodY小量表达实验 | 第29-30页 |
| 2.3.6 转录因子CodY大量的纯化 | 第30-32页 |
| 2.4 转录因子CodY与探针的体外结合 | 第32-35页 |
| 2.4.1 Cy5 荧光探针的制备 | 第32页 |
| 2.4.2 native-page(非变性)聚丙烯酰胺凝胶制备 | 第32-33页 |
| 2.4.3 凝胶电泳迁移体系及溶液配制 | 第33-34页 |
| 2.4.4 凝胶电泳迁移实验(EMSAs) | 第34-35页 |
| 2.5 实验结果与讨论 | 第35-39页 |
| 2.5.1 ddl、murC、murD、murG启动子片段扩增 | 第35页 |
| 2.5.2 转录因子CodY纯化 | 第35-36页 |
| 2.5.3 目的片段与CodY转录因子体外结合 | 第36-38页 |
| 2.5.4 支链氨基酸(BCAAs)对CodY与 DNA结合的作用研究 | 第38-39页 |
| 2.6 本章小结 | 第39-41页 |
| 第3章 CodY与 DNA结合Motif的研究 | 第41-51页 |
| 3.1 引言 | 第41页 |
| 3.2 实验材料 | 第41-42页 |
| 3.2.1 Motif预测网站 | 第41页 |
| 3.2.2 主要药品 | 第41-42页 |
| 3.2.3 实验试剂与耗材 | 第42页 |
| 3.2.4 实验仪器与设备 | 第42页 |
| 3.3 试验方法 | 第42-46页 |
| 3.3.1 MEME CodY结合序列(Motif)的预测 | 第42-44页 |
| 3.3.2 Cy5荧光探针的制备 | 第44-45页 |
| 3.3.3 native-page(非变性)聚丙烯酰胺凝胶制备 | 第45页 |
| 3.3.4 凝胶电泳迁移体系及溶液配制 | 第45页 |
| 3.3.5 凝胶电泳迁移试验(EMSAs) | 第45-46页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第46-49页 |
| 3.4.1 转录因子CodY结合Motif预测 | 第46-47页 |
| 3.4.2 转录因子CodY与ddl转录起始区结合Motif | 第47-49页 |
| 3.5 本章小结 | 第49-51页 |
| 第4章 转录调节因子CodY蛋白与DNA结合关键氨基酸的预测及验证 | 第51-69页 |
| 4.1 引言 | 第51页 |
| 4.2 实验材料 | 第51-53页 |
| 4.2.1 分子对接软件、分子模拟网站 | 第51-52页 |
| 4.2.2 实验菌株与培养基 | 第52-53页 |
| 4.2.3 主要药品 | 第53页 |
| 4.2.4 实验试剂与耗材 | 第53页 |
| 4.2.5 实验仪器与设备 | 第53页 |
| 4.3 实验方法 | 第53-60页 |
| 4.3.1 分子模拟CodY蛋白结构 | 第53-54页 |
| 4.3.2 转录调控因子CodY与 DNA启动子的模拟 | 第54页 |
| 4.3.3 定点突变引物设计与验证 | 第54-55页 |
| 4.3.4 质粒的提取 | 第55-56页 |
| 4.3.5 目的片段扩增与纯化 | 第56-57页 |
| 4.3.6 DH5α、BL21感受态的制备 | 第57页 |
| 4.3.7 大肠杆菌电转化实验和筛选 | 第57-59页 |
| 4.3.8 突变CodY蛋白的表达纯化 | 第59-60页 |
| 4.4 突变转录因子CodY与探针的体外结合 | 第60-61页 |
| 4.4.1 Cy5 荧光探针的制备 | 第60页 |
| 4.4.2 native-page(非变性)聚丙烯酰胺凝胶制备 | 第60页 |
| 4.4.3 凝胶电泳迁移试验(EMSAs) | 第60-61页 |
| 4.5 结果与讨论 | 第61-68页 |
| 4.5.1 分子模拟CodY与 ddl基因启动子结合 | 第61-62页 |
| 4.5.2 突变CodY菌株构建 | 第62-63页 |
| 4.5.3 转录因子CodY关键氨基酸突变 | 第63-65页 |
| 4.5.4 突变CodY转录因子的纯化 | 第65-67页 |
| 4.5.5 目的片段与CodY转录因子体外结合 | 第67-68页 |
| 4.6 本章小结 | 第68-69页 |
| 第5章 结论与展望 | 第69-71页 |
| 5.1 研究总结 | 第69-70页 |
| 5.2 展望 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-79页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第79-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
