| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一部分 前言 | 第14-23页 |
| 1.1 Bt杀虫晶体蛋白的分类 | 第14-16页 |
| 1.2 已报道的昆虫中肠Bt毒素受体蛋白及其分类 | 第16-19页 |
| 1.2.1 钙黏蛋白 | 第17页 |
| 1.2.2 碱性磷酸酶 | 第17-18页 |
| 1.2.3 氨肽酶N | 第18页 |
| 1.2.4 糖脂 | 第18页 |
| 1.2.5 ABC转运蛋白 | 第18-19页 |
| 1.3 Bt毒素导致昆虫病变的主要假说 | 第19-20页 |
| 1.4 昆虫对Bt毒素产生抗性的机制 | 第20-22页 |
| 1.4.1 Bt杀虫晶体蛋白的溶解与活化介导的抗性 | 第21页 |
| 1.4.2 Bt毒素受体蛋白改变介导的抗性 | 第21-22页 |
| 1.5 研究意义 | 第22-23页 |
| 第二部分 实验材料 | 第23-29页 |
| 2.1 细胞系及其培养基 | 第23页 |
| 2.2 菌种和质粒 | 第23页 |
| 2.3 主要实验药品和试剂 | 第23-24页 |
| 2.4 主要实验仪器与型号 | 第24页 |
| 2.5 主要溶液的配制 | 第24-26页 |
| 2.5.1 5xTBE 缓冲液(1L) | 第24页 |
| 2.5.2 氯化锂法提质粒时溶液 | 第24-25页 |
| 2.5.3 播酸盐缓冲液PBS (1L) | 第25页 |
| 2.5.4 Puck's液(1L) | 第25页 |
| 2.5.5 IPTG储存液(50mL) | 第25页 |
| 2.5.6 X-gal溶液 | 第25页 |
| 2.5.7 氨苄青霉素与卡那霉素溶液 | 第25页 |
| 2.5.8 MTT溶液 | 第25页 |
| 2.5.9 斜纹夜蛾中肠组织基因组DNA提取时裂解液 | 第25页 |
| 2.5.10 斜纹夜蛾Sl-HP细胞基因组DNA提取时清洗液 | 第25-26页 |
| 2.6 常用培养基的配制 | 第26页 |
| 2.6.1 LB液体培养基 | 第26页 |
| 2.6.2 LB固体培养基 | 第26页 |
| 2.6.3 转染和培养用昆虫细胞培养基 | 第26页 |
| 2.7 实验中用到引物的名称和及其序列 | 第26-29页 |
| 第三部分 实验方法 | 第29-37页 |
| 3.1 氯化锂法提取质粒 | 第29页 |
| 3.2 昆虫细胞与组织RNA的提取 | 第29-30页 |
| 3.3 SlABCCs相关基因cDNA的合成 | 第30页 |
| 3.3.1 基因组DNA的除去反应 | 第30页 |
| 3.3.2 逆转录合成cDNA | 第30页 |
| 3.4 斜纹夜蛾中肠组织基因组DNA的提取 | 第30-31页 |
| 3.5 斜纹夜蛾S1-HP细胞基因组DNA的提取 | 第31-32页 |
| 3.6 Cellfectin转染昆虫细胞（以6孔板为例） | 第32页 |
| 3.7 Jetpei转染HEK-293T细胞（以24孔板为例） | 第32页 |
| 3.8 制片与荧光显微镜下观察 | 第32-33页 |
| 3.9 斜纹夜蛾中肠SlABCCs基因表达质粒的构建 | 第33-34页 |
| 3.9.1 pie2-EGFP-N1-SlABCC3真核表达质粒的构建 | 第33页 |
| 3.9.2 pEGFP-N1-SlABCC3真核表达质粒的构建 | 第33-34页 |
| 3.9.3 斜纹夜蛾中肠SlABCC3原核表达质粒的构建 | 第34页 |
| 3.9.4 pie2-EGFP-N1-SlABCC4-like真核表达质粒的构建 | 第34页 |
| 3.10 斜纹夜蛾虫体SlABCC3基因突变的证明 | 第34-35页 |
| 3.11 SlABCC3蛋白原核表达纯化及兔多克隆抗体的制备 | 第35-36页 |
| 3.11.1 SlABCC3蛋白原核表达纯化 | 第35页 |
| 3.11.2 SlABCC3蛋白兔多克隆抗体的制备 | 第35-36页 |
| 3.12 SlABCC4-like基因dsRNA的合成 | 第36页 |
| 3.13 SlABCC4-like基因的干扰对细胞耐受Cry1Ac毒素的处理的影响 | 第36页 |
| 3.14 Cry1Ac毒素处理后不同昆虫细胞相对存活率的测定 | 第36-37页 |
| 第四部分 实验结果 | 第37-66页 |
| 4.1 不同昆虫细胞对Cry1Ac毒素的敏感性分析 | 第37页 |
| 4.2 S1-HP细胞转录组数据分析 | 第37-39页 |
| 4.3 SlABCC3的生物信息学分析 | 第39-43页 |
| 4.3.1 SlABCC3蛋白的基本特征及与其他蛋白的比较分析 | 第39-40页 |
| 4.3.2 SlABCC3蛋白三维结构预测 | 第40页 |
| 4.3.3 SlABCC3蛋白信号肽及跨膜结构域预测 | 第40-42页 |
| 4.3.4 SlABCC3蛋白糖基化位点预测 | 第42页 |
| 4.3.5 SlABCC3蛋白基序 | 第42-43页 |
| 4.4 SlABCC3基因的克隆及其与细胞对Bt毒素敏感性的关系 | 第43-49页 |
| 4.4.1 pT-SlABCC3L和pT-SlABCC3R质粒的构建 | 第43页 |
| 4.4.2 少量斜纹夜蛾虫体SlABCC3突变的证明 | 第43-44页 |
| 4.4.3 pie2-EGFP-N1-SlABCC3真核表达质粒的构建 | 第44-45页 |
| 4.4.4 SlABCC3在TnH5和S1-HP细胞中的定位 | 第45-46页 |
| 4.4.5 SlABCC3与内质网标签蛋白在TnH5细胞中的共定位 | 第46页 |
| 4.4.6 超表达SlABCC3后Sl-HP细胞对Cry1Ac毒素敏感性分析 | 第46-47页 |
| 4.4.7 超表达SlABCC3后TnH5细胞对Cry1Ac毒素敏感性分析 | 第47-48页 |
| 4.4.8 超表达SlABCC3后TnH5细胞对Cry1Ca毒素敏感性分析 | 第48-49页 |
| 4.5 SlABCC3在HEK-293T细胞中超表达 | 第49-50页 |
| 4.5.1 pEGFP-N1-SlABCC3真核表达质粒的构建 | 第49页 |
| 4.5.2 SlABCC3在HEK-293T细胞中的表达 | 第49-50页 |
| 4.6 SlABCC3蛋白的原核表达和兔多克隆抗体的制备 | 第50-52页 |
| 4.6.1 pET-28a(+)-tSlABCC3原核表达质粒的构建 | 第50页 |
| 4.6.2 SlABCC3蛋白兔多克隆抗体的制备 | 第50-52页 |
| 4.7 SlABCC4-like的干扰及干扰后Sl-HP细胞对Bt毒素敏感性分析 | 第52-56页 |
| 4.7.1 SlABCC4-like dsRNA的合成 | 第52-53页 |
| 4.7.2 SlABCC4-like干扰后Sl-HP细胞对Cry1Ac毒素的敏感性分析 | 第53-54页 |
| 4.7.3 干扰后S1-HP细胞对CrylCa毒素敏感性分析 | 第54-56页 |
| 4.8 SlABCC4-like生物信息学分析 | 第56-60页 |
| 4.8.1 SlABCC4-like的基本特征及与SlABCC3序列比对 | 第56-57页 |
| 4.8.2 SlABCC4-like蛋白三维结构预测 | 第57-58页 |
| 4.8.3 SlABCC4-like蛋白信号肽及跨膜结构域预测 | 第58-59页 |
| 4.8.4 SlABCC4-like蛋白糖基化位点预测 | 第59-60页 |
| 4.8.5 SlABCC4-like蛋白基序 | 第60页 |
| 4.9 SlABCC4-like基因的克隆及其与细胞对Bt毒素敏感性的关系 | 第60-66页 |
| 4.9.1 pT-SlABCC4LLF和pT-SlABCC4LRF质粒的构建 | 第60-61页 |
| 4.9.2 pie2-EGFP-N1-SlABCC4-like真核表达质粒的构建 | 第61-62页 |
| 4.9.3 SlABCC4-like在TnH5和Sl-HP细胞中的定位 | 第62页 |
| 4.9.4 SlABCC4-like与内质网标签蛋白在Sl-HP细胞中的共定位 | 第62-63页 |
| 4.9.5 SlABCC4-like超表达后TnH5细胞对Cry1Ac毒素敏感性分析 | 第63页 |
| 4.9.6 SlABCC4-like超表达后TnH5细胞对Cry1Fa毒素敏感性分析 | 第63-64页 |
| 4.9.7 SlABCC-like超表达后TnH5细胞对Cy1Ab与Cry2Aa毒素敏感性分析 | 第64-66页 |
| 第五部分 结论与讨论 | 第66-68页 |
| 5.1 SlABCC3蛋白作为Cry1Ac毒素受体的证明 | 第66-67页 |
| 5.2 SlABCC3基因突变与斜纹夜蛾对Cry1Ac毒素抗性的关系 | 第67页 |
| 5.3 SlABCC4-like蛋白与Bt毒素毒力间的关系 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-74页 |
| 硕士期间发表论文 | 第74-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
