| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第一部分 前言 | 第11-23页 |
| 1.1 细胞自噬概念 | 第11-13页 |
| 1.1.1 细胞自噬的方式 | 第11-12页 |
| 1.1.2 自噬的特征与检测 | 第12-13页 |
| 1.2 细胞自噬机制 | 第13-19页 |
| 1.2.1 自噬的诱导及其调控 | 第13-16页 |
| 1.2.2 自噬的发生过程 | 第16-17页 |
| 1.2.3 自噬的分子机制 | 第17-19页 |
| 1.3 自噬相关基因 | 第19-20页 |
| 1.3.1 多种自噬相关基因 | 第19-20页 |
| 1.3.2 自噬相关基因Atg1的简介 | 第20页 |
| 1.4 蛋白质互作技术的研究与进展 | 第20-22页 |
| 1.5 本课题研究目的与意义 | 第22-23页 |
| 第二部分 实验材料 | 第23-29页 |
| 2.1 细胞系和细胞培养基 | 第23页 |
| 2.2 质粒和菌株 | 第23-24页 |
| 2.3 主要药品与试剂 | 第24页 |
| 2.4 常用溶液及其配制 | 第24-27页 |
| 2.4.1 磷酸盐缓冲液(PBS) | 第24页 |
| 2.4.2 5×TBE | 第24页 |
| 2.4.3 抗生素 | 第24-25页 |
| 2.4.4 碱裂解法所用溶液 | 第25页 |
| 2.4.5 蛋白凝胶电泳系列溶液 | 第25-26页 |
| 2.4.6 免疫印迹(Western Blot)相关溶液 | 第26页 |
| 2.4.7 NP-40 Lysis Buffer(细胞裂解液) | 第26-27页 |
| 2.4.8 SDS-PAGE凝胶及Tricine-PAGE凝胶的配制 | 第27页 |
| 2.5 常用培养基的配制 | 第27-28页 |
| 2.5.1 Grace's Insect Cell Culture Medium(1L) | 第27-28页 |
| 2.5.2 LB培养基 | 第28页 |
| 2.6 主要实验仪器及型号 | 第28-29页 |
| 第三部分 实验方法 | 第29-40页 |
| 3.1 斜纹夜蛾ATG1及ATG5表达质粒的构建 | 第29-33页 |
| 3.1.1 原核表达质粒的构建 | 第29-30页 |
| 3.1.2 真核表达质粒的构建 | 第30-32页 |
| 3.1.3 重组杆状病毒的构建 | 第32-33页 |
| 3.2 E.COLI DH10BAC感受态细胞的制备 | 第33页 |
| 3.3 氯化锂法提质粒 | 第33-34页 |
| 3.4 斜纹夜蛾ATG1以及ATG5的原核表达 | 第34-35页 |
| 3.5 脂质体法转染昆虫细胞 | 第35页 |
| 3.6 细胞免疫荧光 | 第35-36页 |
| 3.7 WESTERN BLOT分析 | 第36页 |
| 3.8 PULL DOWN操作 | 第36-37页 |
| 3.9 免疫共沉淀法 | 第37-38页 |
| 3.10 双分子荧光技术(BIFC) | 第38页 |
| 3.11 细胞的冻存与复苏 | 第38-40页 |
| 第四部分 实验结果 | 第40-60页 |
| 4.1 ATG1与ATG5的相互关系 | 第40-42页 |
| 4.1.1 ATG1与ATG8的相互关系 | 第40页 |
| 4.1.2 ATG5与ATG8的相互关系 | 第40-41页 |
| 4.1.3 ATG1与ATG5可能的相互关系 | 第41-42页 |
| 4.2 载体构建 | 第42-45页 |
| 4.2.1 ATG1与ATG5的原核表达载体的构建 | 第42-43页 |
| 4.2.2 ATG1与ATG1-N重组杆状病毒表达系统的构建 | 第43页 |
| 4.2.3 共定位相关真核表达载体的构建 | 第43-44页 |
| 4.2.4 BIFC相关真核表达载体的构建 | 第44-45页 |
| 4.3 原核与真核蛋白的表达 | 第45-47页 |
| 4.3.1 ATG1与ATG5的原核表达 | 第45-46页 |
| 4.3.2 ATG1与ATG1-N的重组杆状病毒表达 | 第46-47页 |
| 4.4 Co-IP技术探索ATG1与ATG5的相互作用 | 第47-50页 |
| 4.4.1 以ATG5为诱饵蛋白的Co-IP | 第47-48页 |
| 4.4.2 以ATG1为诱饵蛋白的Co-IP | 第48-49页 |
| 4.4.3 以ATG1为诱饵蛋白的内源性Co-IP | 第49-50页 |
| 4.5 PULL-DOWN技术探索ATG1与ATG5的相互作用 | 第50-52页 |
| 4.6 双分子荧光互补技术探索ATG1与ATG5的相互作用 | 第52页 |
| 4.7 ATG1的活性区域分析 | 第52-58页 |
| 4.7.1 ATG1的结构域分析 | 第52-54页 |
| 4.7.2 ATG1截短体与ATG5的共定位 | 第54-55页 |
| 4.7.3 ATG1截短体与ATG5相互作用的双分子荧光互补验证 | 第55-56页 |
| 4.7.4 Pull down技术验证ATG1截短体与ATG5的相互作用 | 第56-57页 |
| 4.7.5 ATG1活性位点的进一步探索 | 第57-58页 |
| 4.8 ATG1与ATG5相互作用的功能分析 | 第58-60页 |
| 第五部分 讨论 | 第60-64页 |
| 5.1 ATG1的同源物具有不同特性 | 第60页 |
| 5.2 斜纹夜蛾ATG1与ATG5互作位点的研究 | 第60-62页 |
| 5.3 ATG1与ATG5相互作用的本质 | 第62页 |
| 5.4 ATG1与ATG5相互作用在自噬中的生理意义 | 第62-63页 |
| 5.5 全文总结 | 第63-64页 |
| 本论文的创新之处 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
