| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 第一章 绪论 | 第11-24页 |
| 1.1 L-2-氨基丁酸的概述 | 第11-16页 |
| 1.1.1 L-2-氨基丁酸的应用 | 第11-12页 |
| 1.1.2 L-2-氨基丁酸的制备方法 | 第12-16页 |
| 1.2 L-苏氨酸脱氨酶的性质与结构特征 | 第16-18页 |
| 1.2.1 L-苏氨酸脱氨酶的性质 | 第16页 |
| 1.2.2 L-苏氨酸脱氨酶的结构特征 | 第16-18页 |
| 1.3 L-亮氨酸脱氢酶的结构特征与分子改造 | 第18-20页 |
| 1.3.1 L-亮氨酸脱氢酶的结构特征 | 第18-19页 |
| 1.3.2 L-亮氨酸脱氢酶的分子改造 | 第19-20页 |
| 1.4 辅酶NADH循环体系的构建 | 第20-22页 |
| 1.4.1 辅酶NADH再生的概述 | 第20-21页 |
| 1.4.2 辅酶再生系统的构建 | 第21-22页 |
| 1.5 论文的选题背景及意义 | 第22-24页 |
| 1.5.1 立项依据及研究意义 | 第22页 |
| 1.5.2 主要研究内容 | 第22-24页 |
| 第二章 理性设计解除L-苏氨酸脱氨酶受L-Ile异构抑制 | 第24-45页 |
| 2.1 引言 | 第24页 |
| 2.2 方法和材料 | 第24-29页 |
| 2.2.1 菌株和材料 | 第24-25页 |
| 2.2.2 L-苏氨酸脱氨酶C端切除突变体的菌株构建与酶的表达与纯化 | 第25-26页 |
| 2.2.3 L-苏氨酸脱氨酶及其突变体的酶活及动力学测定 | 第26页 |
| 2.2.4 等温滴定微量热法(ITC)测定L-Ile与酶的结合 | 第26-27页 |
| 2.2.5 Fe_3O_4纳米材料的制备与分析测定 | 第27页 |
| 2.2.6 Fe_3O_4纳米材料对于聚集体的包覆 | 第27-28页 |
| 2.2.7 红外光谱的测定方法 | 第28页 |
| 2.2.8 离子强度、温和溶剂及表面活性剂对包覆量及酶活的影响 | 第28页 |
| 2.2.9 磁性纳米材料包覆前后的酶转化制备2-酮丁酸 | 第28-29页 |
| 2.2.10 结构模型分析与分子动力学模拟分析方法 | 第29页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第29-44页 |
| 2.3.1 通过理性设计EcTD的C端调控域获得活性聚集体 | 第29-32页 |
| 2.3.2 活性聚集体解除了L-Ile的异构抑制 | 第32-35页 |
| 2.3.3 L-Ile对突变TD催化合成2-酮丁酸的影响 | 第35页 |
| 2.3.4 活性聚集体形成后的结构变化分析 | 第35-38页 |
| 2.3.5 Fe_3O_4纳米材料对于活性聚集体的包覆 | 第38-39页 |
| 2.3.6 Fe_3O_4纳米材料与活性聚集体的结合机制探讨 | 第39-41页 |
| 2.3.7 包覆后的活性聚集体用于2-酮丁酸的制备 | 第41-44页 |
| 2.4 本章小结 | 第44-45页 |
| 第三章 L-亮氨酸脱氢酶的底物通道改造 | 第45-63页 |
| 3.1 引言 | 第45页 |
| 3.2 材料和方法 | 第45-50页 |
| 3.2.1 质粒、菌种和材料 | 第45页 |
| 3.2.2 定点突变引物 | 第45-47页 |
| 3.2.3 BcLeuDH及其突变体的表达、纯化与酶活测定 | 第47页 |
| 3.2.4 BcLeuDH及其突变体的温度与pH稳定性测定 | 第47-48页 |
| 3.2.5 BcLeuDH及其突变体的动力学参数及全吸收光谱测定 | 第48页 |
| 3.2.6 构建辅酶循环制备α-氨基酸 | 第48页 |
| 3.2.7 氨基酸和有机酸的分析测定方法 | 第48-49页 |
| 3.2.8 蛋白质结构模拟及分析 | 第49-50页 |
| 3.3 结果和分析 | 第50-62页 |
| 3.3.1 基于酶的结构比对筛选BcLeuDH的突变点 | 第50-53页 |
| 3.3.2 BcLeuDH及突变体对于α-酮酸底物的动力学分析 | 第53-57页 |
| 3.3.3 BcLeuDH及突变体的温度及pH稳定性 | 第57-58页 |
| 3.3.4 构建辅酶循环体系不对称合成α-氨基酸 | 第58-59页 |
| 3.3.5 BcLeuDH催化α-酮酸的氨化还原机制分析 | 第59-62页 |
| 3.4 本章小结 | 第62-63页 |
| 第四章 具备工业价值的NADH再生用酶挖掘 | 第63-80页 |
| 4.1 引言 | 第63页 |
| 4.2 材料和方法 | 第63-73页 |
| 4.2.1 菌株与质粒、培养基与试剂 | 第63-68页 |
| 4.2.2 主要仪器与耗材 | 第68页 |
| 4.2.3 细菌基因组DNA的提取 | 第68-69页 |
| 4.2.4 引物的设计及质粒的构建 | 第69-71页 |
| 4.2.5 重组大肠杆菌的蛋白表达 | 第71页 |
| 4.2.6 NADH再生用酶的酶活测定方法 | 第71页 |
| 4.2.7 L-2-氨基丁酸的酶转化 | 第71-72页 |
| 4.2.8 L-2-氨基丁酸的全细胞转化 | 第72页 |
| 4.2.9 (S)-2-羟基丁酸的酶法制备 | 第72页 |
| 4.2.10 氨基酸和有机酸的分析测定方法 | 第72页 |
| 4.2.11 生物信息学分析网站及工具 | 第72-73页 |
| 4.3 结果和讨论 | 第73-78页 |
| 4.3.1 辅因子NADH再生用酶的筛选 | 第73-74页 |
| 4.3.2 L-2-氨基丁酸的酶法制备 | 第74页 |
| 4.3.3 全细胞转化制备L-2-氨基丁酸 | 第74-75页 |
| 4.3.4 全细胞转化液中的氨基酸及有机酸含量 | 第75-76页 |
| 4.3.5 L-乳酸脱氢酶的筛选用于制备(S)-2-羟基丁酸 | 第76-77页 |
| 4.3.6 (S)-2-羟基丁酸的酶法制备 | 第77-78页 |
| 4.4 本章小结 | 第78-80页 |
| 第五章 多酶催化的单细胞构建与L-2-氨基丁酸高产 | 第80-92页 |
| 5.1 引言 | 第80-81页 |
| 5.2 材料与方法 | 第81-84页 |
| 5.2.1 材料和试剂 | 第81-82页 |
| 5.2.2 L-苏氨酸及2-酮丁酸转化速率的测定 | 第82-83页 |
| 5.2.3 不同强度RBS的设计 | 第83页 |
| 5.2.4 制备L-2-氨基丁酸单细胞的构建 | 第83页 |
| 5.2.5 L-2-氨基丁酸的高效制备 | 第83-84页 |
| 5.3 结果和讨论 | 第84-91页 |
| 5.3.1 多酶催化体系转化速率的平衡 | 第84-85页 |
| 5.3.2 不同强度RBS对2-酮丁酸转化效率的影响 | 第85页 |
| 5.3.3 多酶协同表达系统单细胞的构建 | 第85-87页 |
| 5.3.4 单细胞高效制备L-2-氨基丁酸 | 第87-89页 |
| 5.3.5 公司20吨级发酵罐制备L-2-氨基丁酸 | 第89-90页 |
| 5.3.6 单细胞用于制备L-2-氨基丁酸的成本核算 | 第90-91页 |
| 5.4 本章小结 | 第91-92页 |
| 结论 | 第92-94页 |
| 论文创新点 | 第94-95页 |
| 致谢 | 第95-97页 |
| 参考文献 | 第97-113页 |
| 附录 | 第113-115页 |
