| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第11-27页 |
| 1.1 生物催化与手性药物 | 第11-12页 |
| 1.1.1 生物催化 | 第11页 |
| 1.1.2 手性和手性药物 | 第11-12页 |
| 1.2 手性醇及研究进展 | 第12-15页 |
| 1.2.1 手性醇的生物合成及应用 | 第12-13页 |
| 1.2.2 手性双芳基醇(R/S)-4-氯苯基-吡啶-2-基甲醇合成方法 | 第13-14页 |
| 1.2.3 抗组胺药物及其市场 | 第14-15页 |
| 1.3 醇脱氢酶 | 第15-20页 |
| 1.3.1 醇脱氢酶的分类、结构及反应机理 | 第15-17页 |
| 1.3.2 醇脱氢酶的立体选择性调控 | 第17-19页 |
| 1.3.3 醇脱氢酶的分子改造方法 | 第19-20页 |
| 1.4 蛋白质结晶及结构解析 | 第20-22页 |
| 1.4.1 X射线衍射的原理 | 第20-21页 |
| 1.4.2 蛋白质结晶方法 | 第21页 |
| 1.4.3 蛋白质晶体结构解析 | 第21-22页 |
| 1.5 计算机模拟酶催化反应机理 | 第22-24页 |
| 1.5.1 同源建模 | 第22页 |
| 1.5.2 分子对接 | 第22-23页 |
| 1.5.3 分子动力学模拟 | 第23-24页 |
| 1.6 金属螯合固定化技术 | 第24页 |
| 1.6.1 金属亲和吸附蛋白质原理 | 第24页 |
| 1.6.2 金属亲和吸附固定蛋白质的优缺点 | 第24页 |
| 1.7 本课题立体依据及主要研究内容 | 第24-27页 |
| 1.7.1 研究目的及意义 | 第24-25页 |
| 1.7.2 主要研究内容 | 第25-27页 |
| 第二章 建立醇脱氢酶催化活性的高通量筛选方法 | 第27-41页 |
| 2.0 引言 | 第27-28页 |
| 2.1 材料与方法 | 第28页 |
| 2.2 材料方法 | 第28-31页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第28页 |
| 2.2.2 实验仪器 | 第28页 |
| 2.2.3 CPMK及手性CPMA的HPLC检测方法 | 第28-29页 |
| 2.2.4 确定DNPH法检测波长 | 第29页 |
| 2.2.5 测定检出限 | 第29页 |
| 2.2.6 测定皮尔逊相关系数 | 第29页 |
| 2.2.7 测定加标回收率 | 第29页 |
| 2.2.8 DNPH检测法用于96孔板高通量筛选 | 第29-30页 |
| 2.2.9 构建随机突变文库 | 第30-31页 |
| 2.2.10 DNPH法表征KpADH及突变体底物谱 | 第31页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第31-40页 |
| 2.3.1 确定DNPH检测波长 | 第32页 |
| 2.3.2 测定反应体系内各组分检测限 | 第32-33页 |
| 2.3.3 DNPH检测法测定CPMK浓度线性范围与准确度 | 第33-34页 |
| 2.3.4 测定DNPH检测法与HPLC检测法皮尔逊相关系数 | 第34页 |
| 2.3.5 DNPH检测法测定CPMK浓度加标回收率 | 第34-35页 |
| 2.3.6 DNPH检测法测定CPMK不对称还原的时间进程 | 第35-36页 |
| 2.3.7 构建KpADH随机突变文库 | 第36-37页 |
| 2.3.8 DNPH检测法筛选KpADH随机突变文库 | 第37-38页 |
| 2.3.9 DNPH检测法测定KpADH及其突变体的底物谱 | 第38-40页 |
| 2.4 本章小结 | 第40-41页 |
| 第三章 极性筛选策略改造KpADH的立体选择性 | 第41-67页 |
| 3.1 引言 | 第41页 |
| 3.2 材料与方法 | 第41-45页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第41页 |
| 3.2.2 实验仪器 | 第41-42页 |
| 3.2.3 同源建模 | 第42页 |
| 3.2.4 分子对接 | 第42页 |
| 3.2.5 底物结合口袋位点Asn/Val扫描 | 第42-43页 |
| 3.2.6 构建立体选择性相关位点饱和突变文库 | 第43页 |
| 3.2.7 构建迭代组合突变文库 | 第43页 |
| 3.2.8 测定KpADH及突变体的还原活力 | 第43-44页 |
| 3.2.9 测定动力学参数 | 第44页 |
| 3.2.10 制备手性CPMA | 第44页 |
| 3.2.11 测定比旋光度 | 第44-45页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第45-66页 |
| 3.3.1 KpADH同源建模 | 第45-46页 |
| 3.3.2 KpADH模型与CPMK分子对接 | 第46-47页 |
| 3.3.3 底物结合口袋重塑策略改造KpADH立体选择性 | 第47-48页 |
| 3.3.4 极性筛选策略改造KpADH立体选择性 | 第48-49页 |
| 3.3.5 天冬酰胺及缬氨酸扫描获得KpADH立体选择性相关核心位点 | 第49-50页 |
| 3.3.6 KpADH立体选择性相关核心位点饱和突变库构建及筛选 | 第50-56页 |
| 3.3.7 逐步优化组合筛选策略 | 第56-57页 |
| 3.3.8 筛选还原合成(S)-CPMK突变体 | 第57-61页 |
| 3.3.9 筛选还原合成(R)-CPMK突变体 | 第61-62页 |
| 3.3.10 游离细胞水相体系制备手性CPMA | 第62-66页 |
| 3.4 本章小结 | 第66-67页 |
| 第四章 KpADH蛋白结晶及立体选择性翻转的机制分析 | 第67-85页 |
| 4.1 引言 | 第67页 |
| 4.2 材料方法 | 第67-71页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第67页 |
| 4.2.2 实验仪器 | 第67-68页 |
| 4.2.3 发酵产酶及蛋白纯化 | 第68页 |
| 4.2.4 制备蛋白质晶体 | 第68-69页 |
| 4.2.5 蛋白质晶体数据收集及解析 | 第69页 |
| 4.2.6 晶体结构与CPMK分子对接 | 第69页 |
| 4.2.7 预反应状态模型下分子动力学模拟 | 第69-70页 |
| 4.2.8 约束条件下分子动力学模拟 | 第70页 |
| 4.2.9 测定催化芳基酮/酮酯底物谱立体选择性 | 第70-71页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第71-83页 |
| 4.3.1 KpADH及突变体蛋白纯化 | 第71页 |
| 4.3.2 KpADH及突变体蛋白结晶 | 第71-72页 |
| 4.3.3 KpADH及突变体蛋白晶体数据收集与解析 | 第72-73页 |
| 4.3.4 KpADH与其突变体晶体结构比对 | 第73-74页 |
| 4.3.5 KpADH及其突变体蛋白晶体与CPMK分子对接 | 第74-76页 |
| 4.3.6 预反应状态下KpADH及其突变体分子动力学模拟 | 第76-78页 |
| 4.3.7 约束条件下KpADH及其突变体分子动力学模拟 | 第78-80页 |
| 4.3.8 KpADH及其突变体催化还原底物谱 | 第80-83页 |
| 4.4 本章小结 | 第83-85页 |
| 第五章 固定化酶连续反应制备(S)-CPMA | 第85-102页 |
| 5.1 引言 | 第85页 |
| 5.2 材料方法 | 第85-89页 |
| 5.2.0 实验材料 | 第85页 |
| 5.2.1 实验仪器 | 第85页 |
| 5.2.2 金属离子对游离酶活力 | 第85-86页 |
| 5.2.3 测定固定化酶反应柱蛋白质上载量 | 第86页 |
| 5.2.4 测定固定化处理酶活力损失 | 第86页 |
| 5.2.5 测定固定化酶反应柱稀释率 | 第86-87页 |
| 5.2.6 替换亲和标签6×His-tag为Heli-tag | 第87页 |
| 5.2.7 固定化酶反应条件优化 | 第87页 |
| 5.2.8 测定树脂静态吸附率/解吸附率 | 第87-88页 |
| 5.2.9 测定树脂对NADP+吸附能力 | 第88页 |
| 5.2.10 测定树脂动态吸附量 | 第88页 |
| 5.2.11 固定化酶连续反应 | 第88-89页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第89-100页 |
| 5.3.1 设计固定化酶连续反应装置 | 第89-90页 |
| 5.3.2 筛选固定化酶载体材料 | 第90页 |
| 5.3.3 Ni-NTA和Mn-NTA固定化效果比较 | 第90-92页 |
| 5.3.4 Heli-tag与6×His-tag标签吸附能力比较 | 第92-94页 |
| 5.3.5 优化固定化酶反应条件 | 第94-98页 |
| 5.3.6 筛选大孔树脂 | 第98-100页 |
| 5.3.7 固定化酶连续反应催化合成(S)-CPMA | 第100页 |
| 5.4 本章小结 | 第100-102页 |
| 主要结论与展望 | 第102-104页 |
| 主要结论 | 第102-103页 |
| 展望 | 第103-104页 |
| 论文主要创新点 | 第104-105页 |
| 致谢 | 第105-107页 |
| 参考文献 | 第107-115页 |
| 附录 :作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第115页 |
