| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩略语表(Abbreviation) | 第12-15页 |
| 第1章 文献综述 | 第15-45页 |
| 1.1 冠状病毒简介 | 第15-22页 |
| 1.1.1 冠状病毒分类 | 第15页 |
| 1.1.2 冠状病毒基因组的特征 | 第15-16页 |
| 1.1.3 冠状病毒复制与转录 | 第16-21页 |
| 1.1.4 病毒组装及释放 | 第21-22页 |
| 1.2 冠状病毒辅助蛋白功能研究 | 第22-33页 |
| 1.2.1 α冠状病毒辅助蛋白 | 第23-24页 |
| 1.2.2 β冠状病毒辅助蛋白 | 第24-30页 |
| 1.2.3 γ冠状病毒辅助蛋白 | 第30-31页 |
| 1.2.4 δ冠状病毒辅助蛋白 | 第31-33页 |
| 1.3 冠状病毒调控Ⅰ型干扰素产生的信号通路 | 第33-42页 |
| 1.3.1 病毒RNA诱导Ⅰ型干扰素产生信号通路 | 第33-38页 |
| 1.3.2 病毒蛋白拮抗Ⅰ型干扰素产生的策略 | 第38-42页 |
| 1.4 猪δ冠状病毒研究进展 | 第42-45页 |
| 第2章 研究目的与意义 | 第45-46页 |
| 第3章 材料与方法 | 第46-65页 |
| 3.1 实验材料 | 第46-51页 |
| 3.1.1 细胞、毒株与菌株 | 第46页 |
| 3.1.2 动物免疫相关材料 | 第46页 |
| 3.1.3 载体与质粒 | 第46-48页 |
| 3.1.4 工具酶及主要相关试剂 | 第48页 |
| 3.1.5 抗体及转染相关试剂 | 第48-49页 |
| 3.1.6 细胞及细菌培养所需材料及其配制 | 第49页 |
| 3.1.7 主要缓冲液及相关试剂配制 | 第49-51页 |
| 3.1.8 实验室主要仪器设备 | 第51页 |
| 3.1.9 分子生物学分析软件 | 第51页 |
| 3.2 实验方法 | 第51-65页 |
| 3.2.1 PDCoV的增殖 | 第51-52页 |
| 3.2.2 病毒滴度的测定 | 第52页 |
| 3.2.3 病毒总RNA的提取 | 第52页 |
| 3.2.4 RT-PCR扩增目的片段 | 第52-53页 |
| 3.2.5 PCR产物及酶切产物回收与纯化 | 第53-54页 |
| 3.2.6 外源DNA片段与载体的连接反应 | 第54页 |
| 3.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第54页 |
| 3.2.8 连接产物的转化 | 第54-55页 |
| 3.2.9 质粒的制备与鉴定 | 第55页 |
| 3.2.10 阳性重组质粒的鉴定 | 第55页 |
| 3.2.11 质粒构建 | 第55-57页 |
| 3.2.12 PDCoV NS6和NS7蛋白的原核表达 | 第57页 |
| 3.2.13 包涵体蛋白纯化 | 第57页 |
| 3.2.14 PDCoV NS6和NS7蛋白单克隆抗体的制备 | 第57-60页 |
| 3.2.15 双荧光素酶实验 | 第60页 |
| 3.2.16 SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR | 第60-61页 |
| 3.2.17 间接免疫荧光实验 | 第61页 |
| 3.2.18 免疫共沉淀及蛋白免疫印迹实验 | 第61-63页 |
| 3.2.19 RNA结合实验 | 第63页 |
| 3.2.20 PDCoV病毒粒子的超离纯化与电镜分析 | 第63-64页 |
| 3.2.21 统计学方法 | 第64-65页 |
| 第4章 结果与分析 | 第65-88页 |
| 4.1 PDCoV辅助蛋白NS6的鉴定 | 第65-71页 |
| 4.1.1 PDCoV NS6亚基因组的鉴定 | 第65-67页 |
| 4.1.2 NS6蛋白的原核表达及纯化 | 第67-68页 |
| 4.1.3 NS6单克隆抗体的制备及鉴定 | 第68-69页 |
| 4.1.4 NS6蛋白亚细胞定位 | 第69-71页 |
| 4.2 PDCoV辅助蛋白NS7的鉴定及NS7a的发现 | 第71-79页 |
| 4.2.1 NS7蛋白原核表达及纯化 | 第71页 |
| 4.2.2 NS7单克隆抗体制备及鉴定 | 第71-74页 |
| 4.2.3 新辅助蛋白NS7a的鉴定 | 第74-77页 |
| 4.2.4 不同毒株NS7a的保守性分析 | 第77-79页 |
| 4.3 PDCoV NS6蛋白抑制IFN-β产生机制 | 第79-88页 |
| 4.3.1 PDCoV NS6抑制SeV诱导的IFN-β产生 | 第79-80页 |
| 4.3.2 PDCoV NS6抑制IRF3和NF-κB活性 | 第80-81页 |
| 4.3.3 PDCoV NS6作用的靶点位于RIG-I/MDA5上游 | 第81-82页 |
| 4.3.4 NS6抑制SeV/poly(I:C)激活的RIG-I/MDA5活性 | 第82-83页 |
| 4.3.5 NS6与RIG-I/MDA5互作 | 第83-85页 |
| 4.3.6 NS6与RIG-I的CTD以及MDA5的Hel和CTD相互作用 | 第85-86页 |
| 4.3.7 NS6为非RNA结合蛋白 | 第86-87页 |
| 4.3.8 NS6减弱了RIG-I/MDA5与dsRNA的结合 | 第87-88页 |
| 第5章 讨论与结论 | 第88-94页 |
| 5.1 讨论 | 第88-93页 |
| 5.1.1 PDCoV辅助蛋白NS6的表达及定位 | 第88-90页 |
| 5.1.2 PDCoV编码一个新的辅助蛋白NS7a | 第90-91页 |
| 5.1.3 PDCoV辅助蛋白NS6抑制IFN-β产生的机制研究 | 第91-93页 |
| 5.2 结论 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-120页 |
| 附录 | 第120-122页 |
| 致谢 | 第122-123页 |
