致谢 | 第5-6页 |
第一部分 摘要 | 第6-8页 |
第一部分 Abstract | 第8-10页 |
第二部分 摘要 | 第10-12页 |
第二部分 Abstract | 第12-19页 |
第一部分 问号钩端螺旋体c-di-GMP信号通路初探 | 第19-96页 |
第一章 引言 | 第19-27页 |
1.1 c-di-GMP的合成 | 第20-21页 |
1.2 c-di-GMP的降解 | 第21页 |
1.3 感知结构域调控c-di-GMP | 第21页 |
1.4 c-di-GMP受体 | 第21-23页 |
1.4.1 PilZ结构域蛋白 | 第21-22页 |
1.4.2 I-位点和无降解酶活性的EAL和HD-GYP结构域蛋白 | 第22页 |
1.4.3 无典型结构域的c-di-GMP受体 | 第22-23页 |
1.4.4 c-di-GMP核糖开关 | 第23页 |
1.5 c-di-GMP的生物学功能 | 第23-25页 |
1.5.1 调控细菌的生物膜的形成 | 第23-24页 |
1.5.2 调控细菌的运动性 | 第24页 |
1.5.3 调控毒力因子的产生 | 第24-25页 |
1.5.4 c-di-GMP当作免疫佐剂 | 第25页 |
1.6 本研究的目的及意义 | 第25-27页 |
第二章 材料与方法 | 第27-56页 |
1 材料与试剂 | 第27-32页 |
1.1 主要试剂 | 第27-28页 |
1.2 主要溶液的配置 | 第28-31页 |
1.3 菌株和细胞系及培养条件 | 第31页 |
1.4 质粒载体 | 第31页 |
1.5 主要仪器 | 第31-32页 |
2 常规分子生物学实验操作 | 第32-49页 |
2.1 问号钩端螺旋体基因组DNA的提取 | 第32-33页 |
2.2 问号钩端螺旋体总RNA的提取 | 第33-34页 |
2.3 cDNA的合成 | 第34-35页 |
2.4 PCR引物设计 | 第35-40页 |
2.4.1 LA2926~LA2933操纵子扩增引物设计 | 第35页 |
2.4.2 原核表达载体构建引物设计 | 第35-38页 |
2.4.3 荧光定量PCR引物设计 | 第38-40页 |
2.5 PCR扩增 | 第40-42页 |
2.5.1 LA2926~LA2933操纵子验证PCR扩增反应 | 第40页 |
2.5.2 PCR扩增基因ORF全序列 | 第40-41页 |
2.5.3 Real-time PCR | 第41-42页 |
2.6 PCR扩增产物的回收 | 第42-43页 |
2.7 载体及PCR产物酶切 | 第43页 |
2.8 DNA凝胶回收 | 第43-44页 |
2.9 连接与转化 | 第44页 |
2.10 质粒提取 | 第44-45页 |
2.11 重组蛋白的表达 | 第45页 |
2.12 SDS-PAGE电泳 | 第45-46页 |
2.13 重组蛋白的纯化 | 第46-47页 |
2.14 BCA法蛋白浓度的测定 | 第47-48页 |
2.15 生物信息学分析 | 第48-49页 |
3 运用报告质粒测定DGCs和PDEs酶活性的测定 | 第49-50页 |
4 HPLC体外检测DGCs和PDEs酶活性 | 第50页 |
4.1 酶反应体系 | 第50页 |
4.2 高效液相色谱(HPLC)检测 | 第50页 |
5 c-di-GMP含量的测定 | 第50-51页 |
5.1 钩体细胞内核酸分子的提取 | 第50-51页 |
5.2 HPLC-MS/MS定量分析c-di-GMP | 第51页 |
6 钩体感染细胞模型 | 第51-52页 |
7 钩体PilZ结构域蛋白与c-di-GMP的结合实验 | 第52-56页 |
第三章 结果与分析 | 第56-82页 |
1 问号钩体赖株56601 c-di-GMP代谢相关基因的预测及结构分析 | 第56-59页 |
2 钩端螺旋体属c-di-GMP代谢相关基因的遗传进化分析 | 第59-65页 |
3 问号钩端螺旋体c-di-GMP代谢相关蛋白的酶活性测定 | 第65-70页 |
3.1 双荧光报告基因检测问号钩体DGCs和PDEs蛋白酶活性 | 第65-67页 |
3.2 DGCs和PDEs重组蛋白体外酶活性的测定 | 第67-70页 |
3.2.1 重组蛋白的表达与纯化 | 第68页 |
3.2.2 重组蛋白体外酶活性测定 | 第68-70页 |
4 PAS,REC和GAF结构域缺失对GGDEF结构域蛋白酶活性的影响 | 第70-72页 |
4.1 Truncated LA2932,truncated LA1483和truncated LA2528酶活性的测定 | 第70-71页 |
4.2 HPLC检测Truncated LA2528酶活性 | 第71-72页 |
5 温度对钩体c-di-GMP含量及其代谢相关基因表达量的影响 | 第72-75页 |
5.1 温度对钩体c-di-GMP含量的影响 | 第73页 |
5.2 温度对钩体c-di-GMP代谢相关基因的表达量的影响 | 第73-75页 |
6 钩体c-di-GMP代谢相关基因的相对表达丰度 | 第75-76页 |
7 钩体感染宿主细胞后c-di-GMP及其代谢相关基因表达量的变化 | 第76-78页 |
7.1 钩体感染J774A.1细胞后c-di-GMP含量的测定 | 第76页 |
7.2 钩体感染J774A.1和THP-1细胞期间c-di-GMP代谢相关基因的表达 | 第76-78页 |
8 钩体c-di-GMP与PilZ蛋白互作实验 | 第78-82页 |
8.1 钩体PilZ结构域蛋白序列分析 | 第78-80页 |
8.2 钩体PilZ结构域蛋白的表达的与纯化 | 第80页 |
8.3 钩体PilZ重组蛋白与Biotin-c-di-GMP的结合实验 | 第80-82页 |
第四章 讨论 | 第82-86页 |
参考文献 | 第86-96页 |
第二部分 问号钩体T-细胞和B-细胞多表位联合疫苗的制备及其保护性评价 | 第96-128页 |
第一章 引言 | 第96-101页 |
1 菌体疫苗 | 第96-97页 |
2 LPS疫苗 | 第97-98页 |
3 外膜疫苗 | 第98页 |
4 重组蛋白疫苗 | 第98-99页 |
5 本研究的意义 | 第99-101页 |
第二章 材料与方法 | 第101-113页 |
1 材料与试剂 | 第101-106页 |
1.1 主要试剂 | 第101-102页 |
1.2 主要溶液的配置 | 第102-105页 |
1.3 菌株和细胞系及培养条件 | 第105页 |
1.4 质粒载体 | 第105-106页 |
1.5 实验动物 | 第106页 |
1.6 主要仪器 | 第106页 |
2 常规分子生物学实验操作 | 第106-107页 |
3 多表位融合蛋白基因序列设计与合成 | 第107-109页 |
4 多表位融合蛋白的表达与纯化 | 第109页 |
5 内毒素的去除及检测 | 第109页 |
6 免疫原性分析 | 第109-111页 |
6.1 动物免疫 | 第109页 |
6.2 Western blot抗血清检测 | 第109-110页 |
6.3 ELISA检测免疫小鼠特异性抗体IgG1和IgG2a | 第110页 |
6.4 小鼠脾脏T淋巴细胞的分离培养 | 第110-111页 |
6.5 淋巴细胞增殖检测 | 第111页 |
6.6 淋巴细胞外分泌细胞因子IFN-γ和IL-4检测 | 第111页 |
7 r4R抗血清与不同血清型钩体的凝集反应 | 第111页 |
8 钩体半数致死量(LD_(50)) | 第111-112页 |
9 钩体攻毒实验 | 第112页 |
10 组织病理学 | 第112页 |
11 数据统计学分析 | 第112-113页 |
第三章 结果与分析 | 第113-120页 |
1 多表位融合蛋白基因序列设计 | 第113页 |
2 重组多表位融合蛋白的表达与纯化 | 第113-114页 |
3 Western blot检测r4R重组蛋白的免疫原性及免疫反应 | 第114-115页 |
4 r4R重组蛋白疫苗诱导Th1型免疫应答 | 第115页 |
5 r4R抗血清交叉免疫反应 | 第115-116页 |
6 脾淋巴细胞增殖及其细胞因子的分泌 | 第116-117页 |
7 r4R疫苗抗钩体感染的保护效力 | 第117-120页 |
第四章 讨论 | 第120-123页 |
参考文献 | 第123-128页 |
作者筒历及攻读博士学位期间取得的科研成果 | 第128页 |