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问号钩端螺旋体c-di-GMP信号通路初步探究及其多表位联合疫苗的研发

致谢第5-6页
第一部分 摘要第6-8页
第一部分 Abstract第8-10页
第二部分 摘要第10-12页
第二部分 Abstract第12-19页
第一部分 问号钩端螺旋体c-di-GMP信号通路初探第19-96页
    第一章 引言第19-27页
        1.1 c-di-GMP的合成第20-21页
        1.2 c-di-GMP的降解第21页
        1.3 感知结构域调控c-di-GMP第21页
        1.4 c-di-GMP受体第21-23页
            1.4.1 PilZ结构域蛋白第21-22页
            1.4.2 I-位点和无降解酶活性的EAL和HD-GYP结构域蛋白第22页
            1.4.3 无典型结构域的c-di-GMP受体第22-23页
            1.4.4 c-di-GMP核糖开关第23页
        1.5 c-di-GMP的生物学功能第23-25页
            1.5.1 调控细菌的生物膜的形成第23-24页
            1.5.2 调控细菌的运动性第24页
            1.5.3 调控毒力因子的产生第24-25页
            1.5.4 c-di-GMP当作免疫佐剂第25页
        1.6 本研究的目的及意义第25-27页
    第二章 材料与方法第27-56页
        1 材料与试剂第27-32页
            1.1 主要试剂第27-28页
            1.2 主要溶液的配置第28-31页
            1.3 菌株和细胞系及培养条件第31页
            1.4 质粒载体第31页
            1.5 主要仪器第31-32页
        2 常规分子生物学实验操作第32-49页
            2.1 问号钩端螺旋体基因组DNA的提取第32-33页
            2.2 问号钩端螺旋体总RNA的提取第33-34页
            2.3 cDNA的合成第34-35页
            2.4 PCR引物设计第35-40页
                2.4.1 LA2926~LA2933操纵子扩增引物设计第35页
                2.4.2 原核表达载体构建引物设计第35-38页
                2.4.3 荧光定量PCR引物设计第38-40页
            2.5 PCR扩增第40-42页
                2.5.1 LA2926~LA2933操纵子验证PCR扩增反应第40页
                2.5.2 PCR扩增基因ORF全序列第40-41页
                2.5.3 Real-time PCR第41-42页
            2.6 PCR扩增产物的回收第42-43页
            2.7 载体及PCR产物酶切第43页
            2.8 DNA凝胶回收第43-44页
            2.9 连接与转化第44页
            2.10 质粒提取第44-45页
            2.11 重组蛋白的表达第45页
            2.12 SDS-PAGE电泳第45-46页
            2.13 重组蛋白的纯化第46-47页
            2.14 BCA法蛋白浓度的测定第47-48页
            2.15 生物信息学分析第48-49页
        3 运用报告质粒测定DGCs和PDEs酶活性的测定第49-50页
        4 HPLC体外检测DGCs和PDEs酶活性第50页
            4.1 酶反应体系第50页
            4.2 高效液相色谱(HPLC)检测第50页
        5 c-di-GMP含量的测定第50-51页
            5.1 钩体细胞内核酸分子的提取第50-51页
            5.2 HPLC-MS/MS定量分析c-di-GMP第51页
        6 钩体感染细胞模型第51-52页
        7 钩体PilZ结构域蛋白与c-di-GMP的结合实验第52-56页
    第三章 结果与分析第56-82页
        1 问号钩体赖株56601 c-di-GMP代谢相关基因的预测及结构分析第56-59页
        2 钩端螺旋体属c-di-GMP代谢相关基因的遗传进化分析第59-65页
        3 问号钩端螺旋体c-di-GMP代谢相关蛋白的酶活性测定第65-70页
            3.1 双荧光报告基因检测问号钩体DGCs和PDEs蛋白酶活性第65-67页
            3.2 DGCs和PDEs重组蛋白体外酶活性的测定第67-70页
                3.2.1 重组蛋白的表达与纯化第68页
                3.2.2 重组蛋白体外酶活性测定第68-70页
        4 PAS,REC和GAF结构域缺失对GGDEF结构域蛋白酶活性的影响第70-72页
            4.1 Truncated LA2932,truncated LA1483和truncated LA2528酶活性的测定第70-71页
            4.2 HPLC检测Truncated LA2528酶活性第71-72页
        5 温度对钩体c-di-GMP含量及其代谢相关基因表达量的影响第72-75页
            5.1 温度对钩体c-di-GMP含量的影响第73页
            5.2 温度对钩体c-di-GMP代谢相关基因的表达量的影响第73-75页
        6 钩体c-di-GMP代谢相关基因的相对表达丰度第75-76页
        7 钩体感染宿主细胞后c-di-GMP及其代谢相关基因表达量的变化第76-78页
            7.1 钩体感染J774A.1细胞后c-di-GMP含量的测定第76页
            7.2 钩体感染J774A.1和THP-1细胞期间c-di-GMP代谢相关基因的表达第76-78页
        8 钩体c-di-GMP与PilZ蛋白互作实验第78-82页
            8.1 钩体PilZ结构域蛋白序列分析第78-80页
            8.2 钩体PilZ结构域蛋白的表达的与纯化第80页
            8.3 钩体PilZ重组蛋白与Biotin-c-di-GMP的结合实验第80-82页
    第四章 讨论第82-86页
    参考文献第86-96页
第二部分 问号钩体T-细胞和B-细胞多表位联合疫苗的制备及其保护性评价第96-128页
    第一章 引言第96-101页
        1 菌体疫苗第96-97页
        2 LPS疫苗第97-98页
        3 外膜疫苗第98页
        4 重组蛋白疫苗第98-99页
        5 本研究的意义第99-101页
    第二章 材料与方法第101-113页
        1 材料与试剂第101-106页
            1.1 主要试剂第101-102页
            1.2 主要溶液的配置第102-105页
            1.3 菌株和细胞系及培养条件第105页
            1.4 质粒载体第105-106页
            1.5 实验动物第106页
            1.6 主要仪器第106页
        2 常规分子生物学实验操作第106-107页
        3 多表位融合蛋白基因序列设计与合成第107-109页
        4 多表位融合蛋白的表达与纯化第109页
        5 内毒素的去除及检测第109页
        6 免疫原性分析第109-111页
            6.1 动物免疫第109页
            6.2 Western blot抗血清检测第109-110页
            6.3 ELISA检测免疫小鼠特异性抗体IgG1和IgG2a第110页
            6.4 小鼠脾脏T淋巴细胞的分离培养第110-111页
            6.5 淋巴细胞增殖检测第111页
            6.6 淋巴细胞外分泌细胞因子IFN-γ和IL-4检测第111页
        7 r4R抗血清与不同血清型钩体的凝集反应第111页
        8 钩体半数致死量(LD_(50))第111-112页
        9 钩体攻毒实验第112页
        10 组织病理学第112页
        11 数据统计学分析第112-113页
    第三章 结果与分析第113-120页
        1 多表位融合蛋白基因序列设计第113页
        2 重组多表位融合蛋白的表达与纯化第113-114页
        3 Western blot检测r4R重组蛋白的免疫原性及免疫反应第114-115页
        4 r4R重组蛋白疫苗诱导Th1型免疫应答第115页
        5 r4R抗血清交叉免疫反应第115-116页
        6 脾淋巴细胞增殖及其细胞因子的分泌第116-117页
        7 r4R疫苗抗钩体感染的保护效力第117-120页
    第四章 讨论第120-123页
    参考文献第123-128页
作者筒历及攻读博士学位期间取得的科研成果第128页

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