| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 英文缩略词表 | 第14-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-32页 |
| 1.1 谷氨酸棒状杆菌 | 第15-17页 |
| 1.2 谷氨酸棒状杆菌基因组遗传操作技术的发展 | 第17-21页 |
| 1.2.1 整合型质粒介导的同源重组 | 第17-18页 |
| 1.2.2 Cre/lox系统介导的特异位点重组系统 | 第18-19页 |
| 1.2.3 噬菌体重组酶协助的同源重组 | 第19-21页 |
| 1.3 代谢工程育种 | 第21-25页 |
| 1.3.1 利用代谢工程的方法理性设计天然氨基酸合成的主要策略 | 第21-23页 |
| 1.3.2 谷氨酸棒状杆菌氨基酸生产菌株代谢工程育种的发展 | 第23页 |
| 1.3.3 L-精氨酸生产菌株的代谢工程育种 | 第23-25页 |
| 1.4 精氨酸敏感型的N-乙酰谷氨酸激酶 | 第25-28页 |
| 1.4.1 NAGK | 第25页 |
| 1.4.2 NAGK的催化机制 | 第25-26页 |
| 1.4.3 精氨酸敏感型NAGK的六聚体结构 | 第26-27页 |
| 1.4.4 精氨酸敏感型NAGK的别构调控机制 | 第27-28页 |
| 1.4.5 精氨酸敏感型NAGK的研究进展 | 第28页 |
| 1.5 本课题的研究意义及主要研究内容 | 第28-32页 |
| 1.5.1 本课题的研究意义 | 第28-29页 |
| 1.5.2 本课题的主要研究内容 | 第29-32页 |
| 第二章 谷氨酸棒状杆菌ATCC14067中基于RecET的基因敲除体系的建立 | 第32-62页 |
| 2.1 引言 | 第32-33页 |
| 2.2 实验设备与材料 | 第33-41页 |
| 2.2.1 主要仪器与设备 | 第33-34页 |
| 2.2.2 质粒、菌株、引物与线性表达盒 | 第34-40页 |
| 2.2.3 主要试剂 | 第40页 |
| 2.2.4 培养基及试剂的配置 | 第40-41页 |
| 2.3 实验方法 | 第41-48页 |
| 2.3.1 重组质粒的构建 | 第41-44页 |
| 2.3.2 谷氨酸棒状杆菌中表达RecET的感受态的制备 | 第44页 |
| 2.3.3 谷氨酸棒状杆菌的电击转化与培养 | 第44页 |
| 2.3.4 线性敲除表达盒的构建 | 第44-46页 |
| 2.3.5 重组分析 | 第46-47页 |
| 2.3.6 Cre酶的诱导表达及无痕敲除菌株的筛选 | 第47-48页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第48-60页 |
| 2.4.1 在ATCC14067中不同来源的核酸外切酶-重组酶对的重组活性 | 第48-50页 |
| 2.4.2 RecET重组条件的优化 | 第50-55页 |
| 2.4.3 RecET-Cre/lox系统介导的无痕敲除体系的建立 | 第55-60页 |
| 2.5 本章小结 | 第60-62页 |
| 第三章 L-精氨酸合成途径限速酶N-乙酰谷氨酸激酶的反馈抑制机制的解析 | 第62-97页 |
| 3.1 引言 | 第62-63页 |
| 3.2 实验设备与材料 | 第63-68页 |
| 3.2.1 主要仪器与设备 | 第63页 |
| 3.2.2 质粒、菌株与引物 | 第63-67页 |
| 3.2.3 主要试剂 | 第67页 |
| 3.2.4 培养基及试剂的配置 | 第67-68页 |
| 3.3 实验方法 | 第68-75页 |
| 3.3.1 CgNAGK及其突变体蛋白表达质粒的构建 | 第68-72页 |
| 3.3.2 CgNAGK及其突变体蛋白的表达与纯化 | 第72-73页 |
| 3.3.3 CgNAGK及其突变体分子量的测定 | 第73-74页 |
| 3.3.4 NAGK酶学性质及精氨酸耐受性的分析 | 第74-75页 |
| 3.3.5 CgNAGK的同源建模 | 第75页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第75-96页 |
| 3.4.1 CgNAGK及其突变体表达载体的构建及鉴定 | 第75-76页 |
| 3.4.2 CgNAGK的性质 | 第76-77页 |
| 3.4.3 CgNAGK六聚体结构与功能的关系 | 第77-84页 |
| 3.4.4 N-helix上与L-精氨酸别构抑制作用相关的氨基酸 | 第84-86页 |
| 3.4.5 CgNAGK上与L-精氨酸相互作用的氨基酸的作用 | 第86-94页 |
| 3.4.6 解除L-精氨酸对CgNAGK的别构抑制作用 | 第94页 |
| 3.4.7 L-精氨酸别构调控CgNAGK的联动性机制 | 第94-96页 |
| 3.5 本章小结 | 第96-97页 |
| 第四章 L-精氨酸合成途径的代谢工程改造 | 第97-114页 |
| 4.1 引言 | 第97-98页 |
| 4.2 实验设备与材料 | 第98-103页 |
| 4.2.1 主要仪器与设备 | 第98页 |
| 4.2.2 质粒、菌株和引物 | 第98-101页 |
| 4.2.3 主要试剂 | 第101-102页 |
| 4.2.4 培养基及试剂的配置 | 第102-103页 |
| 4.3 实验方法 | 第103-107页 |
| 4.3.1 谷氨酸棒状杆菌中表达质粒的构建 | 第103-104页 |
| 4.3.2 红色荧光蛋白mCherry的荧光测定 | 第104页 |
| 4.3.3 基因组相关启动子替换表达盒的构建 | 第104-105页 |
| 4.3.4 基因组上启动子替换菌株的构建 | 第105页 |
| 4.3.5 摇瓶发酵的条件 | 第105-106页 |
| 4.3.6 分批补料发酵培养的条件 | 第106页 |
| 4.3.7 HPLC法测定氨基酸的含量 | 第106-107页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第107-112页 |
| 4.4.1 组成型强启动子表达质粒的构建 | 第107-108页 |
| 4.4.2 L-精氨酸合成途径的增强与优化 | 第108-110页 |
| 4.4.3 TCA循环的增强与优化 | 第110-111页 |
| 4.4.4 菌株GHCI-BGHP的分批补料发酵 | 第111-112页 |
| 4.5 本章小结 | 第112-114页 |
| 结论与展望 | 第114-117页 |
| 结论 | 第114-115页 |
| 本论文创新点 | 第115-116页 |
| 展望 | 第116-117页 |
| 参考文献 | 第117-126页 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 | 第126-128页 |
| 致谢 | 第128-130页 |
| 附录 | 第130页 |
