| 目录 | 第5-10页 |
| 摘要 | 第10-13页 |
| ABSTRACT | 第13-16页 |
| 1 绪论 | 第17-35页 |
| 1.1 尼古丁及其理化性质 | 第17页 |
| 1.2 尼古丁对环境的污染及生物毒性 | 第17-19页 |
| 1.2.1 不同来源的尼古丁对环境的污染 | 第17-18页 |
| 1.2.2 尼古丁的生物毒性 | 第18-19页 |
| 1.3 微生物降解尼古丁的机制研究进展 | 第19-30页 |
| 1.3.1 降解尼古丁的微生物种类 | 第19-21页 |
| 1.3.2 尼古丁的微生物代谢途径及分子机制 | 第21-30页 |
| 1.4 微生物降解尼古丁的应用研究 | 第30-32页 |
| 1.5 本研究的目的、意义和主要内容 | 第32-35页 |
| 1.5.1 研究的目的和意义 | 第32-33页 |
| 1.5.2 研究的主要内容 | 第33-35页 |
| 2 尼古丁降解菌Pseudomonas sp.HZN6的分离、鉴定、降解特性及降解途径的研究 | 第35-49页 |
| 2.1 引言 | 第35页 |
| 2.2 材料与方法 | 第35-40页 |
| 2.2.1 菌株、试剂与培养基 | 第35-36页 |
| 2.2.2 降解菌株的富集与分离 | 第36页 |
| 2.2.3 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定 | 第36页 |
| 2.2.4 菌体基因组DNA的提取 | 第36-37页 |
| 2.2.5 菌株16S rRNA基因的PCR扩增 | 第37页 |
| 2.2.6 16S rRNA基因PCR产物的T/A克隆 | 第37页 |
| 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备与酶连产物的转化 | 第37-38页 |
| 2.2.8 质粒DNA的小量提取 | 第38页 |
| 2.2.9 16S rRNA基因序列测定和系统发育地位的确定 | 第38-39页 |
| 2.2.10 菌体生长量的测定及降解种子液的制备 | 第39页 |
| 2.2.11 尼古丁及中间产物检测方法 | 第39-40页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第40-48页 |
| 2.3.1 尼古丁降解菌株的分离与筛选 | 第40页 |
| 2.3.2 降解菌株的菌落形态及生理生化特征 | 第40-41页 |
| 2.3.3 降解菌株的系统发育地位研究 | 第41-42页 |
| 2.3.4 环境条件对菌株HZN6降解尼古丁的影响 | 第42-45页 |
| 2.3.5 尼古丁的代谢产物鉴定和代谢途径分析 | 第45-48页 |
| 2.4 小结 | 第48-49页 |
| 3 转座子随机突变文库构建与筛选 | 第49-59页 |
| 3.1 引言 | 第49页 |
| 3.2 材料与方法 | 第49-53页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第49页 |
| 3.2.2 试剂与培养基 | 第49-50页 |
| 3.2.3 菌株的培养条件 | 第50页 |
| 3.2.4 转座子诱变 | 第50-51页 |
| 3.2.5 尼古丁降解失活突变株的筛选 | 第51-52页 |
| 3.2.6 尼古丁降解失活突变株的验证 | 第52-53页 |
| 3.2.7 尼古丁及其中间产物的检测方法 | 第53页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第53-58页 |
| 3.3.1 转座子诱变最优条件的选择 | 第53页 |
| 3.3.2 转座突变的效率 | 第53-54页 |
| 3.3.3 几株代表性突变株的表型分析 | 第54-58页 |
| 3.4 小结 | 第58-59页 |
| 4 3-琥珀酰吡啶降解相关基因sirA2的克隆和功能鉴定 | 第59-85页 |
| 4.1 引言 | 第59页 |
| 4.2 材料与方法 | 第59-72页 |
| 4.2.1 试剂与培养基 | 第59-60页 |
| 4.2.2 菌株、质粒与培养条件 | 第60页 |
| 4.2.3 分子生物学操作方法 | 第60-61页 |
| 4.2.4 转座子插入突变基因的SEFA-PCR克隆 | 第61-63页 |
| 4.2.5 克隆序列的测定、组装与分析 | 第63-64页 |
| 4.2.6 sirA2基因的敲除 | 第64-69页 |
| 4.2.7 sirA2基因的功能互补 | 第69-71页 |
| 4.2.8 重组菌株降解尼古丁、SP和次黄嘌呤的特性分析 | 第71页 |
| 4.2.9 尼古丁、SP和次黄嘌呤的检测方法 | 第71-72页 |
| 4.3 结果与分析 | 第72-80页 |
| 4.3.1 突变株N6ml的筛选与表型分析 | 第72-73页 |
| 4.3.2 SEFA-PCR克隆突变基因 | 第73页 |
| 4.3.3 克隆基因的测序、组装与分析 | 第73-77页 |
| 4.3.4 sirA2基因的敲除与功能互补 | 第77-79页 |
| 4.3.5 钨对SP和次黄嘌呤降解的影响 | 第79-80页 |
| 4.4 讨论 | 第80-82页 |
| 4.4.1 sirA基因的来源与功能 | 第81页 |
| 4.4.2 硫转移酶与羟化酶的相互关系 | 第81-82页 |
| 4.5 小结 | 第82-85页 |
| 5 假氧尼古丁氧化酶和3-琥珀酰半醛吡啶脱氢酶的克隆、表达和酶学特性研究 | 第85-121页 |
| 5.1 引言 | 第85页 |
| 5.2 材料与方法 | 第85-101页 |
| 5.2.1 试剂与培养基 | 第85-86页 |
| 5.2.2 菌株、质粒与培养条件 | 第86-87页 |
| 5.2.3 分子生物学操作方法 | 第87页 |
| 5.2.4 突变株N6mC8突变基因的SEFA-PCR克隆 | 第87页 |
| 5.2.5 克隆序列的测定、组装与分析 | 第87-88页 |
| 5.2.6 假氧尼古丁氧化酶和3-琥珀酰半醛吡啶脱氢酶的异源表达和纯化 | 第88-92页 |
| 5.2.7 尼古丁及代谢产物的检测方法 | 第92-93页 |
| 5.2.8 酶的功能鉴定、动力学参数测定及酶学特性分析 | 第93-95页 |
| 5.2.9 pao和sap基因的敲除 | 第95-99页 |
| 5.2.10 pao基因的功能互补 | 第99-101页 |
| 5.2.11 重组菌株降解特性分析 | 第101页 |
| 5.3 结果与分析 | 第101-118页 |
| 5.3.1 突变株N6mC8的筛选与表型分析 | 第101-102页 |
| 5.3.2 SEFA-PCR克隆突变基因 | 第102-103页 |
| 5.3.3 克隆基因的测序、组装与分析 | 第103-105页 |
| 5.3.4 PNAO和SAPD的基因克隆、异源表达与纯化 | 第105-106页 |
| 5.3.5 PNAO的辅酶FAD | 第106-108页 |
| 5.3.6 PNAO的功能鉴定 | 第108-111页 |
| 5.3.7 PNAO的酶学特性与动力学参数 | 第111-114页 |
| 5.3.8 SAPD的功能鉴定 | 第114-116页 |
| 5.3.9 pao和sap基因的敲除与功能互补 | 第116-117页 |
| 5.3.10 重组菌株的降解特性分析 | 第117-118页 |
| 5.4 讨论 | 第118-120页 |
| 5.4.1 pao和sap基因为新基因 | 第119页 |
| 5.4.2 PNAO酶的特性 | 第119-120页 |
| 5.5 小结 | 第120-121页 |
| 6 尼古丁氧化酶基因的克隆和功能鉴定 | 第121-155页 |
| 6.1 引言 | 第121页 |
| 6.2 材料与方法 | 第121-137页 |
| 6.2.1 试剂与培养基 | 第121-122页 |
| 6.2.2 菌株、质粒与培养条件 | 第122-123页 |
| 6.2.3 常规分子生物学操作方法 | 第123页 |
| 6.2.4 pao基因上游基因序列的SEFA-PCR克隆 | 第123页 |
| 6.2.5 克隆序列的测定、组装与分析 | 第123-124页 |
| 6.2.6 尼古丁氧化酶NOX的基因克隆、异源表达与纯化 | 第124-125页 |
| 6.2.7 nox基因的敲除 | 第125-129页 |
| 6.2.8 nox基因的功能互补 | 第129-131页 |
| 6.2.9 RNA的提取与RT-PCR | 第131-132页 |
| 6.2.10 NOX蛋白三维结构的预测与分子对接 | 第132-133页 |
| 6.2.11 NOX蛋白的定点突变 | 第133-136页 |
| 6.2.12 重组菌株降解特性分析 | 第136页 |
| 6.2.13 尼古丁及中间产物的分析方法 | 第136-137页 |
| 6.3 结果与分析 | 第137-151页 |
| 6.3.1 SEFA-PCR克隆pao基因上游未知序列 | 第137-138页 |
| 6.3.2 克隆基因的测序、组装与分析 | 第138-140页 |
| 6.3.3 nox基因的体外功能鉴定 | 第140-142页 |
| 6.3.4 nox基因的转录 | 第142-143页 |
| 6.3.5 nox基因的体内敲除与功能互补 | 第143-145页 |
| 6.3.6 重组菌株的降解特性 | 第145-146页 |
| 6.3.7 NOX的无手性选择性降解尼古丁 | 第146-147页 |
| 6.3.8 NOX的异源表达与纯化 | 第147-149页 |
| 6.3.9 NOX的同源模建与分子对接 | 第149-151页 |
| 6.3.10 NOX的定点突变 | 第151页 |
| 6.4 讨论 | 第151-154页 |
| 6.5 小结 | 第154-155页 |
| 7 论文总结 | 第155-159页 |
| 7.1 研究结论 | 第155-156页 |
| 7.2 创新点 | 第156页 |
| 7.3 不足与展望 | 第156-159页 |
| 参考文献 | 第159-177页 |
| 攻读博士学位期间研究成果与个人荣誉 | 第177-179页 |
| 研究成果 | 第177-178页 |
| 个人荣誉 | 第178-179页 |
| 致谢 | 第179-180页 |
