| 致谢 | 第5-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 第一章 绪论 | 第15-29页 |
| 1.1 γ-氨基丁酸 | 第15-22页 |
| 1.1.1 γ-氨基丁酸(GABA)的结构与性质 | 第15-16页 |
| 1.1.2 GABA的生理功能 | 第16-18页 |
| 1.1.3 GABA的应用 | 第18-20页 |
| 1.1.4 GABA的制备 | 第20-22页 |
| 1.2 乳酸菌概述 | 第22-25页 |
| 1.2.1 乳酸菌及其应用 | 第22-23页 |
| 1.2.2 乳酸菌面临的环境胁迫 | 第23-24页 |
| 1.2.3 乳酸菌抵御酸胁迫的耐受及响应机制 | 第24-25页 |
| 1.3 乳酸菌合成GABA的研究 | 第25-27页 |
| 1.3.1 乳酸菌GAD系统关键蛋白 | 第25-26页 |
| 1.3.2 提升乳酸菌GABA合成能力的研究 | 第26-27页 |
| 1.4 本论文主要研究内容 | 第27-29页 |
| 1.4.1 研究背景及意义 | 第27-28页 |
| 1.4.2 主要研究内容 | 第28-29页 |
| 第二章 不同培养条件下短乳杆菌GAD系统关键基因的表达 | 第29-47页 |
| 2.1 前言 | 第29-30页 |
| 2.2 实验材料与仪器 | 第30-31页 |
| 2.2.1 菌种与试剂 | 第30页 |
| 2.2.2 仪器 | 第30-31页 |
| 2.2.3 培养基 | 第31页 |
| 2.3 实验方法 | 第31-37页 |
| 2.3.1 常用试剂配制 | 第31-32页 |
| 2.3.2 发酵培养方法 | 第32页 |
| 2.3.3 荧光定量PCR测定目的基因的转录情况 | 第32-35页 |
| 2.3.4 弱化F_1F_o-ATPase活性对短乳杆菌合成GABA的影响 | 第35-37页 |
| 2.4 结果讨论 | 第37-44页 |
| 2.4.1 好氧条件下短乳杆菌GAD系统的转录表达 | 第37-38页 |
| 2.4.2 兼性厌氧条件下短乳杆菌GAD系统的转录表达 | 第38-40页 |
| 2.4.3 F_1F_o-ATPase抑制剂DCCD对短乳杆菌细胞生长的影响 | 第40-43页 |
| 2.4.4 兼性厌氧培养条件下DCCD对短乳杆菌GAD关键酶的转录表达情况 | 第43-44页 |
| 2.5 本章小结 | 第44-47页 |
| 第三章 植物乳杆菌源谷氨酸脱羧酶的筛选及酶学性质分析 | 第47-69页 |
| 3.1 前言 | 第47-48页 |
| 3.2 实验材料与仪器 | 第48-50页 |
| 3.2.1 菌种、质粒与试剂 | 第48-49页 |
| 3.2.2 仪器 | 第49页 |
| 3.2.3 细菌培养基 | 第49页 |
| 3.2.4 菌种生理生化鉴定培养基 | 第49-50页 |
| 3.3 实验方法 | 第50-55页 |
| 3.3.1 常用试剂配制 | 第50页 |
| 3.3.2 菌种分离、纯化和保存 | 第50页 |
| 3.3.3 发酵培养方法 | 第50-51页 |
| 3.3.4 菌株16S rRNA分子生物学鉴定 | 第51-52页 |
| 3.3.5 植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆 | 第52页 |
| 3.3.6 大肠杆菌质粒提取 | 第52-53页 |
| 3.3.7 大肠杆菌电转化感受态细胞的制备 | 第53页 |
| 3.3.8 大肠杆菌电击转化 | 第53-54页 |
| 3.3.9 大肠杆菌重组菌株的构建 | 第54页 |
| 3.3.10 重组大肠杆菌的诱导表达 | 第54-55页 |
| 3.3.11 重组GAD的纯化 | 第55页 |
| 3.3.12 重组GAD酶学催化特性分析 | 第55页 |
| 3.3.13 重组GAD蛋白分子量分析 | 第55页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第55-66页 |
| 3.4.1 产GABA植物乳杆菌的分离 | 第55-57页 |
| 3.4.2 生理生化特性 | 第57-58页 |
| 3.4.3 菌株16SrRNA基因系统发育学分析 | 第58-60页 |
| 3.4.4 植物乳杆菌GadB序列特征 | 第60-61页 |
| 3.4.5 植物乳杆菌GadB表达纯化 | 第61页 |
| 3.4.6 植物乳杆菌GadB分子量测定 | 第61-62页 |
| 3.4.7 植物乳杆菌GadB同源模拟 | 第62-64页 |
| 3.4.8 植物乳杆菌GadB活性中心特征 | 第64页 |
| 3.4.9 植物乳杆菌GadB的分子对接 | 第64-65页 |
| 3.4.10 植物乳杆菌GadB酶学催化特性分析 | 第65-66页 |
| 3.5 本章小结 | 第66-69页 |
| 第四章 定向进化谷氨酸脱羧酶提升短乳杆菌GABA合成效率 | 第69-91页 |
| 4.1 前言 | 第69页 |
| 4.2 实验材料与仪器 | 第69-71页 |
| 4.2.1 质粒与菌种 | 第69-70页 |
| 4.2.2 试剂 | 第70页 |
| 4.2.3 仪器 | 第70页 |
| 4.2.4 培养基 | 第70-71页 |
| 4.3 实验方法 | 第71-78页 |
| 4.3.1 易错PCR构建gadB突变体文库 | 第71-72页 |
| 4.3.2 pET28a(+)-GadB_(△11)突变体的诱导表达 | 第72页 |
| 4.3.3 基于pH敏感指示剂比色法的高GAD活性菌株高通量筛选方法建立 | 第72-73页 |
| 4.3.4 GadB_(△11)及突变体的表达和纯化 | 第73-74页 |
| 4.3.5 蛋白酶的SDS-PAGE凝胶电泳 | 第74-75页 |
| 4.3.6 考马斯亮蓝法测定蛋白含量 | 第75-76页 |
| 4.3.7 突变酶GAD活性的测定 | 第76页 |
| 4.3.8 pH对突变体GAD酶活性的影响 | 第76页 |
| 4.3.9 温度对突变体GAD酶活性的影响 | 第76页 |
| 4.3.10 GadB突变体动力学参数的测定 | 第76页 |
| 4.3.11 重组短乳杆菌pMG36e-GadB_(△11)的构建 | 第76-77页 |
| 4.3.12 重组短乳杆菌的发酵培养 | 第77-78页 |
| 4.3.13 短乳杆菌GAD活性的测定 | 第78页 |
| 4.4 结果讨论 | 第78-89页 |
| 4.4.1 C末端截短GadB及其突变体文库构建 | 第78-81页 |
| 4.4.2 基于pH敏感指示剂比色法的高通量筛选法的建立 | 第81-83页 |
| 4.4.3 突变文库的鉴定 | 第83-85页 |
| 4.4.4 pH对C378S突变体酶活的影响 | 第85-86页 |
| 4.4.5 温度对C378S突变体GAD酶活的影响 | 第86-87页 |
| 4.4.6 C378S突变体动力学参数的测定 | 第87-88页 |
| 4.4.7 重组表达C末端截短的GadB突变体提升短乳杆菌GAD活性 | 第88页 |
| 4.4.8 重组表达C378S提升短乳杆菌GABA合成性能 | 第88-89页 |
| 4.5 本章小结 | 第89-91页 |
| 第五章 结论与展望 | 第91-93页 |
| 5.1 结论 | 第91-92页 |
| 5.2 展望 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-102页 |
