| 论文主要创新点 | 第6-13页 |
| 摘要 | 第13-16页 |
| Abstract | 第16-18页 |
| 第一部分 植物细胞中DNA错配修复机理的生物化学研究 | 第19-60页 |
| 1 文献综述 | 第19-27页 |
| 1.1 错配修复与同源重组 | 第19-20页 |
| 1.2 原核生物中的错配修复机制 | 第20-21页 |
| 1.3 真核生物中错配修复机制 | 第21-24页 |
| 1.4 真核生物中DNA错配修复研究体系 | 第24-25页 |
| 1.5 植物错配修复研究进展 | 第25-26页 |
| 1.6 目的和意义 | 第26-27页 |
| 2 材料与方法 | 第27-32页 |
| 2.1 实验材料 | 第27-29页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第27页 |
| 2.1.2 错配DNA底物 | 第27页 |
| 2.1.3 寡聚核酸序列 | 第27-29页 |
| 2.1.4 试剂耗材 | 第29页 |
| 2.2 实验方法 | 第29-32页 |
| 2.2.1 质粒构建 | 第29页 |
| 2.2.2 LUC错配底物的制备 | 第29页 |
| 2.2.3 原生质体分离与转化 | 第29-30页 |
| 2.2.4 在原生质体中检测DNA的错配修复 | 第30页 |
| 2.2.5 XhoI-Adapter制备 | 第30页 |
| 2.2.6 连接介导的体外错配修复实验(LMDA) | 第30-31页 |
| 2.2.7 拟南芥幼苗组织细胞核蛋白的提取 | 第31页 |
| 2.2.8 拟南芥原生质体核蛋白提取 | 第31-32页 |
| 3 实验结果与分析 | 第32-52页 |
| 3.1 体外检测拟南芥核蛋白对错配DNA底物的修复作用 | 第32-38页 |
| 3.1.1 体外DNA错配修复实验原理 | 第32-33页 |
| 3.1.2 拟南芥幼苗细胞核蛋白提取 | 第33-34页 |
| 3.1.3 体外检测拟南芥核蛋白的DNA错配修复活性 | 第34-37页 |
| 3.1.4 采用地高辛标记的方法检测拟南芥核蛋白的体外错配修复结果 | 第37-38页 |
| 3.2 在拟南芥原生质体内检测DNA错配修复的活性 | 第38-44页 |
| 3.2.1 制备含有错配DNA碱基的LUC底物 | 第38-41页 |
| 3.2.1.1 利用单链置换法制备错配底物的设计原理 | 第38-40页 |
| 3.2.1.2 制备和验证含有错配碱基的LUC底物 | 第40-41页 |
| 3.2.2 拟南芥原生质体内的DNA错配修复活性的检测 | 第41-42页 |
| 3.2.3 Nick对拟南芥体内错配修复的影响 | 第42-44页 |
| 3.3 采取LMDA研究拟南芥核蛋白的DNA错配修复活性 | 第44-52页 |
| 3.3.1 连接介导的DNA检测方法(LMDA)的设计与验证 | 第44-47页 |
| 3.3.1.1 LMDA的设计原理 | 第44-45页 |
| 3.3.1.2 采用LMDA检测DNA修复错配结果的可行性分析 | 第45-47页 |
| 3.3.2 拟南芥核蛋白DNA错配修复活性的体外检测 | 第47-49页 |
| 3.3.2.1 拟南芥原生质体细胞核蛋白的提取 | 第47-48页 |
| 3.3.2.2 拟南芥DNA错配修复活性的体外检测 | 第48-49页 |
| 3.3.3 msh2缺失突变体的DNA错配修复活性检测 | 第49-50页 |
| 3.3.4 拟南芥DNA错配修复依赖于底物上的Nick | 第50-52页 |
| 4 讨论 | 第52-55页 |
| 4.1 植物DNA错配修复实验的难点 | 第52页 |
| 4.2 通过检测LUC的活性分析植物细胞中DNA错配修复机制的存在 | 第52-53页 |
| 4.3. 植物细胞核蛋白提取物具有微弱的错配修复活性 | 第53-54页 |
| 4.4 连接介导的DNA检测技术(LMDA)的优点 | 第54-55页 |
| 5 结论 | 第55-56页 |
| 6 参考文献 | 第56-60页 |
| 第二部分 PCR-TES的建立及其在研究ABA信号传导通路中的应用 | 第60-110页 |
| 1 文献综述 | 第60-64页 |
| 1.1 哺乳动物细胞瞬时转化技术 | 第60-62页 |
| 1.2 植物细胞瞬时转化技术 | 第62-63页 |
| 1.2.1 农杆菌转化法 | 第62页 |
| 1.2.2 原生质体转化法 | 第62-63页 |
| 1.3 PCR片段在哺乳动物细胞转化技术中的应用 | 第63-64页 |
| 1.4 本研究的目的和意义 | 第64页 |
| 2 材料与方法 | 第64-75页 |
| 2.1 实验材料 | 第64-70页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第64-65页 |
| 2.1.2 菌株 | 第65页 |
| 2.1.3 质粒 | 第65-67页 |
| 2.1.4 引物 | 第67-70页 |
| 2.1.5 试剂耗材 | 第70页 |
| 2.2 实验方法 | 第70-75页 |
| 2.2.1 PCR-fragments的制备 | 第70-71页 |
| 2.2.2 植物基因组DNA和RNA提取 | 第71-72页 |
| 2.2.3 基因克隆与表达载体的构建 | 第72-73页 |
| 2.2.4 氯化铯梯度离心制备和纯化质粒 | 第73页 |
| 2.2.5 原生质体分离与转化 | 第73页 |
| 2.2.6 基因枪瞬时转化 | 第73-74页 |
| 2.2.7 蛋白斑点杂交 | 第74页 |
| 2.2.8 重组蛋白的原核表达与纯化 | 第74页 |
| 2.2.9 体外磷酸化检测实验 | 第74-75页 |
| 2.2.10 结合PCR-TES的ChIP分析 | 第75页 |
| 3 实验结果与分析 | 第75-101页 |
| 3.1 PCR-TES研究方法的建立和评估 | 第75-84页 |
| 3.1.1 PCR-fragments的制备 | 第75-77页 |
| 3.1.2 基因枪法瞬时转化PCR-fragments到植物细胞中 | 第77-78页 |
| 3.1.3 PCR-TES在植物蛋白亚细胞定位研究中的应用 | 第78-79页 |
| 3.1.4 PCR-fragments在原生质体中的瞬时表达分析 | 第79-84页 |
| 3.1.4.1 PCR-fragments转化到拟南芥原生质体中 | 第79-80页 |
| 3.1.4.2 PCR-fragments和质粒转化效率的比较 | 第80页 |
| 3.1.4.3 鉴定和分析PCR-TES体系的蛋白表达情况 | 第80-82页 |
| 3.1.4.4 评估Fusion PCR方式制备的PCR-fragments在原生质体中的表达 | 第82页 |
| 3.1.4.6 评估来源于基因组DNA的PCR-fragments在原生质体中的表达 | 第82-84页 |
| 3.2 PCR-TES体系的验证 | 第84-87页 |
| 3.2.1 在PCR-TES中检测激素相关基因的表达 | 第84-85页 |
| 3.2.2 重构PYR1介导的ABA信号通路 | 第85-87页 |
| 3.3 应用PCR-TES筛选和分析CDPK家族基因在ABA信号传导中的作用 | 第87-92页 |
| 3.3.1 筛选参与ABA信号传导的CDPK家族的成员 | 第87页 |
| 3.3.2 候选CDPK基因在ABA信号传导中的功能分析 | 第87-91页 |
| 3.3.3 重构CPK4介导的ABA信号通路 | 第91-92页 |
| 3.4 拟南芥转录因子AITR1的初步研究 | 第92-101页 |
| 3.4.1 拟南芥AITR1基因的生物信息学分析 | 第92-93页 |
| 3.4.2 AITR1具有转录抑制功能 | 第93-94页 |
| 3.4.3 AITR1可能绑定A/T-Rich顺势作用元件 | 第94-96页 |
| 3.4.4 ABA能够诱导拟南芥AITR1的表达 | 第96页 |
| 3.4.5 拟南芥AITR1的组织定位 | 第96-99页 |
| 3.4.6 AITR1超表达株系对ABA超敏感 | 第99-101页 |
| 3.4.7 AITR1与CPK4相互作用 | 第101页 |
| 4 讨论 | 第101-105页 |
| 4.1 PCR-TES适用于植物细胞瞬时表达 | 第101-102页 |
| 4.2 应用PCR-TES筛选和分析拟南芥CDPK家族基因的功能 | 第102-104页 |
| 4.3 AITR1参与拟南芥ABA的信号传导 | 第104-105页 |
| 5 结论 | 第105-106页 |
| 6 参考文献 | 第106-110页 |
| 附录 | 第110-115页 |
| 附录-Ⅰ 培养基 | 第110-112页 |
| 附录-Ⅱ 主要化学试剂和仪器 | 第112-115页 |
| 在读期间已发表和正在整理的论文 | 第115-116页 |
| 致谢 | 第116-117页 |
