| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第一章 Mog1和Ran研究进展 | 第13-29页 |
| 1.1 Ran是一个小GTP酶 | 第13-16页 |
| 1.2 Ran的功能 | 第16-20页 |
| 1.2.1 Ran在核质转运中的功能 | 第16-17页 |
| 1.2.2 Ran在有丝分裂纺捶体组装中的作用 | 第17-19页 |
| 1.2.3 Ran在核膜形成中的作用 | 第19-20页 |
| 1.3 Ran的相互作用蛋白 | 第20-25页 |
| 1.3.1 RanGAP催化GTP水解 | 第20-23页 |
| 1.3.2 RCC1催化的核苷酸交换 | 第23-24页 |
| 1.3.3 NTF2介导RanGDP入核 | 第24-25页 |
| 1.4 Mog1的背景介绍 | 第25-29页 |
| 第二章 核磁共振技术研究Mog1和Ran复合物的结构 | 第29-81页 |
| 2.1 引言 | 第29-30页 |
| 2.2 主链化学位移扰动实验研究Mog1和Ran的相互作用 | 第30-36页 |
| 2.2.1 氘代样品Mog1和Ran的制备 | 第30-33页 |
| 2.2.1.1 ~(15)N氘代Mog1的表达和纯化 | 第30-32页 |
| 2.2.1.2 氘代Ran的表达和纯化 | 第32页 |
| 2.2.1.3 核磁滴定样品准备 | 第32-33页 |
| 2.2.2 全氘代非标Ran滴定全氘代~(15)N标记Mog1的化学位移扰动实验 | 第33-36页 |
| 2.3 DMSO淬灭H/D交换方法研究Mog1和Ran复合物作用界面 | 第36-41页 |
| 2.3.1 背景原理 | 第36-37页 |
| 2.3.2 实验材料和实验方法 | 第37-38页 |
| 2.3.3 快速四维谱用于变性蛋白质的主链认证 | 第38-39页 |
| 2.3.4 DMSO淬灭氢氘交换实验结果 | 第39-41页 |
| 2.4 ILV甲基选择性标记样品的甲基化学位移扰动实验 | 第41-47页 |
| 2.4.1 甲基选择性标记技术简介 | 第41-43页 |
| 2.4.2 ILV甲基反标样品的制备 | 第43-44页 |
| 2.4.3 单体Mog1的ILV残基指纹图 | 第44-45页 |
| 2.4.4 甲基滴定实验 | 第45-47页 |
| 2.5 利用甲基反标技术归属复合物态下Mog1和Ran的ILV甲基 | 第47-57页 |
| 2.5.1 甲基选择性标记样品的指认 | 第47-48页 |
| 2.5.2 复合物状态下Mog1的ILV甲基的指认 | 第48-52页 |
| 2.5.2.1 样品制备要求 | 第48页 |
| 2.5.2.2 复合物状态下Mog1的ILV甲基的化学位移归属 | 第48-52页 |
| 2.5.3 Mog1和Ran复合物ILV甲基谱及指认 | 第52-57页 |
| 2.5.3.1 Mog1和Ran共表达的质粒构建及蛋白表达 | 第52-54页 |
| 2.5.3.2 复合物状态下Ran的ILV甲基的化学位移动归属 | 第54-56页 |
| 2.5.3.3 复合物中Ran的化学交换现象 | 第56-57页 |
| 2.6 ILV甲基选择性标记研究Mog1和Ran复合物的相互作用界面 | 第57-63页 |
| 2.6.1 间接维~(15)N去耦/不去耦~(13)C_NOESY鉴别分子内和分子间NOE | 第57-59页 |
| 2.6.2 蛋白样品的制备 | 第59-60页 |
| 2.6.2.1 Mog1作用界面的样品制备 | 第59页 |
| 2.6.2.2 Ran作用界面的样品制备 | 第59-60页 |
| 2.6.3 Mog1和Ran复合物作用界面的确立 | 第60-63页 |
| 2.7 Mog1和Ran复合物上ILV甲基与甲基间的分子间NOE | 第63-64页 |
| 2.7.1 Methyl-Methyl_13C_ NOESY_HMQC | 第63页 |
| 2.7.2 甲基-甲基分子间界面NOE的获得 | 第63-64页 |
| 2.8 ILV甲基RDC实验研究Mog1和Ran复合物的取向 | 第64-73页 |
| 2.8.1 RDC简介 | 第64-67页 |
| 2.8.2 Methyl-TROSY-~1H-~(13)C RDC | 第67页 |
| 2.8.3 RDC样品制备 | 第67-69页 |
| 2.8.3.1 聚丙烯酰胺凝胶介质样品的制备 | 第67-68页 |
| 2.8.3.2 C12E5液晶介质的制备 | 第68-69页 |
| 2.8.3.3 噬菌体pf1介质样品的制备 | 第69页 |
| 2.8.4 Mog1和Ran复合物中ILV甲基的RDC数据分析 | 第69-73页 |
| 2.8.4.1 pf1和gel两种介质的RDC数据采集 | 第69-72页 |
| 2.8.4.2 两种介质pf1和gel的RDC数据一致性与正交性分析 | 第72-73页 |
| 2.9 甲基PRE实验研究Mog1和Ran复合物的结构信息 | 第73-76页 |
| 2.9.1 PRE简介 | 第73页 |
| 2.9.2 样品制备 | 第73-74页 |
| 2.9.3 甲基PRE提供很多分子间的长程约束 | 第74-76页 |
| 2.10 综合多种NMR手段构建复合物的结构模型 | 第76-78页 |
| 2.11 Mog1和Ran复合物ILV残基的甲基立体选择性标记 | 第78-81页 |
| 2.11.1 立体选择性标记简介 | 第78页 |
| 2.11.2 立体选择性标记样品制备 | 第78页 |
| 2.11.3 立体选择性标记有效的减化谱图 | 第78-79页 |
| 2.11.4 空间立体选择性标记有助于获得更准确的结构信息 | 第79-81页 |
| 第三章 基于Mog1和Ran复合物结构模型功能探讨 | 第81-91页 |
| 3.1 Mog1和Ran复合物结构模型可信度检验 | 第81-85页 |
| 3.1.1 Mog1和Ran复合物结构模型细节 | 第81-82页 |
| 3.1.2 GST pull-down验证模型的可信性 | 第82-84页 |
| 3.1.2.1 实验步骤 | 第82-83页 |
| 3.1.2.2 实验结果 | 第83-84页 |
| 3.1.3 SPR测定Ran与Mog1及其突变体Mog1_E50K,E53K的结合能力 | 第84-85页 |
| 3.2 从结构上分析Mog1是Ran核苷酸释放因子 | 第85-89页 |
| 3.2.1 Mog1与Ran结合区域有别于其它Ran结合蛋白 | 第85-87页 |
| 3.2.2 从结构模型推测Mog1促进Ran核苷酸释放的机制 | 第87-89页 |
| 3.3 基于复合物结构的Mog1胞内功能研究 | 第89页 |
| 3.4 总结与展望 | 第89-91页 |
| 附录 | 第91-107页 |
| 一、常规生化试验介绍 | 第91-100页 |
| Ⅰ. PCR扩增及检验回收 | 第91-92页 |
| Ⅱ. 分离纯化DNA目的片段 | 第92-93页 |
| Ⅲ. 提取质粒 | 第93页 |
| Ⅳ. 质粒和DNA片段的酶切连接 | 第93-94页 |
| Ⅴ. 制备大肠杆菌感受态细胞 | 第94页 |
| Ⅵ. 转化及鉴定 | 第94-95页 |
| Ⅶ. 点突变实验 | 第95-96页 |
| Ⅷ. 重组蛋白质的表达 | 第96页 |
| Ⅸ. 重组蛋白的纯化方法 | 第96-98页 |
| Ⅹ. 蛋白电泳(SDSPAGE) | 第98-99页 |
| Ⅺ. 蛋白质浓度测定 | 第99-100页 |
| 二、复合物中甲基约束统计表 | 第100-107页 |
| 表1. Mog1和Ran复合物NMR实验参数 | 第100-101页 |
| 表2. Ran_Cys120-MTSL到Mog1各甲基距离统计表格 | 第101-102页 |
| 表3. Ran_Cys120-MTSL到Ran各甲基距离统计表格 | 第102页 |
| 表4. HADDOCK中界面NOE约束 | 第102-103页 |
| 表5. HADDOCK中PRE长程约束 | 第103-107页 |
| 参考文献 | 第107-113页 |
| 致谢 | 第113-115页 |
| 在读期间发表的学术论文与参加的学术会议 | 第115页 |
