| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第一章 前言 | 第10-22页 |
| 1.1 肝素与硫酸乙酰肝素 | 第10-12页 |
| 1.1.1 肝素的结构及生物学功能 | 第10-11页 |
| 1.1.2 乙酰肝素的结构及生物学功能 | 第11页 |
| 1.1.3 低分子量肝素的作用 | 第11-12页 |
| 1.2 肝素酶的研究进展 | 第12-21页 |
| 1.2.1 肝素酶的来源 | 第12-13页 |
| 1.2.2 肝素酶的生物学功能 | 第13-17页 |
| 1.2.3 肝素酶的作用机制研究 | 第17-20页 |
| 1.2.4 肝素酶的表达及纯化研究 | 第20-21页 |
| 1.3 本课题的研究意义 | 第21-22页 |
| 第二章 肝素酶Ⅰ表达与纯化 | 第22-31页 |
| 2.1 引言 | 第22页 |
| 2.2 实验材料 | 第22-23页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第22页 |
| 2.2.2 酶和试剂 | 第22页 |
| 2.2.3 细菌培养基 | 第22页 |
| 2.2.4 实验中常用溶液和缓冲液的配置 | 第22-23页 |
| 2.3 实验方法 | 第23-25页 |
| 2.3.1 感受态细胞的制备 | 第23页 |
| 2.3.2 质粒的转化 | 第23页 |
| 2.3.3 阳性克隆的筛选鉴定 | 第23页 |
| 2.3.4 肝素酶Ⅰ基因鉴定 | 第23-24页 |
| 2.3.5 重组菌的诱导表达 | 第24页 |
| 2.3.6 肝素酶粗酶液的制备 | 第24页 |
| 2.3.7 表达产物SDS-PAGE分析 | 第24页 |
| 2.3.8 BRADFORD法测定蛋白质浓度 | 第24页 |
| 2.3.9 重组HEPI融合蛋白的纯化 | 第24-25页 |
| 2.4 实验结果与分析 | 第25-30页 |
| 2.4.1 GST-HEPI表达载体的验证 | 第25页 |
| 2.4.2 GST-HEPI融合蛋白的可溶性表达 | 第25-26页 |
| 2.4.3 GST-HEPI的纯化工艺研究 | 第26-30页 |
| 2.5 本章小结 | 第30-31页 |
| 第三章 肝素酶Ⅰ酶学性质研究 | 第31-39页 |
| 3.1 引言 | 第31页 |
| 3.2 实验材料 | 第31页 |
| 3.3 肝素酶Ⅰ活力的测定 | 第31页 |
| 3.4 实验方法 | 第31-32页 |
| 3.4.1 肝素酶Ⅰ活性的最适温度和温度稳定性 | 第31页 |
| 3.4.2 肝素酶Ⅰ活性的最适pH和pH稳定性 | 第31-32页 |
| 3.4.3 其它因素对肝素酶Ⅰ活性影响 | 第32页 |
| 3.4.4 肝素酶Ⅰ的稳定性 | 第32页 |
| 3.5 实验结果与分析 | 第32-38页 |
| 3.5.1 温度对肝素酶Ⅰ活性的影响 | 第32-33页 |
| 3.5.2 pH对肝素酶Ⅰ活性的影响 | 第33-35页 |
| 3.5.3 盐浓度对肝素酶Ⅰ活性影响 | 第35-36页 |
| 3.5.4 金属离子对酶活性的影响 | 第36-37页 |
| 3.5.5 化学试剂对酶活性的影响 | 第37页 |
| 3.5.6 肝素酶Ⅰ的稳定性 | 第37-38页 |
| 3.6 本章小结 | 第38-39页 |
| 第四章 肝素酶Ⅰ裂解肝素研究 | 第39-45页 |
| 4.1 引言 | 第39页 |
| 4.2 实验材料 | 第39页 |
| 4.2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验试剂及其配制 | 第39页 |
| 4.2.2 HPLC实验用原材料及仪器 | 第39页 |
| 4.3 实验检测方法 | 第39-41页 |
| 4.3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法 | 第39-40页 |
| 4.3.2 GST-HEPI裂解产物的SAX-HPLC检测方法 | 第40-41页 |
| 4.4 实验结果分析 | 第41-44页 |
| 4.4.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验结果分析 | 第41-42页 |
| 4.4.2 重组肝素酶Ⅰ对肝素裂解的HPLC的鉴定 | 第42-44页 |
| 4.5 本章小结 | 第44-45页 |
| 第五章 肝素酶的突变 | 第45-55页 |
| 5.1 引言 | 第45页 |
| 5.2 试剂盒突变 | 第45-46页 |
| 5.2.1 试剂盒突变流程 | 第45-46页 |
| 5.2.2 试剂盒引物设计原理 | 第46页 |
| 5.2.3 突变型肝素酶在大肠杆菌中的表达 | 第46页 |
| 5.2.4 突变型肝素酶的活性测定 | 第46页 |
| 5.3 突变方法和材料 | 第46-49页 |
| 5.3.1 材料与仪器 | 第46-47页 |
| 5.3.2 生物试剂 | 第47页 |
| 5.3.3 试剂盒定点法(东洋纺突变试剂盒SMK-101) | 第47-48页 |
| 5.3.4 肝素酶截短基因重组质粒构建法 | 第48-49页 |
| 5.4 实验结果 | 第49-54页 |
| 5.4.1 突变引物设计 | 第49-50页 |
| 5.4.2 肝素酶的突变结果 | 第50-54页 |
| 5.5 本章小结 | 第54-55页 |
| 第六章 总结 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-62页 |
| 致谢 | 第62页 |
