| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩略语表(Abbreviation) | 第10-11页 |
| 1 文献综述 | 第11-25页 |
| 引言 | 第11页 |
| 1.1 布鲁氏菌分类与病原学特点 | 第11-13页 |
| 1.2 国内外布病疫情概况 | 第13-14页 |
| 1.3 布鲁氏菌病的防控现状 | 第14页 |
| 1.4 布鲁氏菌基因编辑技术发展现状 | 第14-15页 |
| 1.5 CRISPR-Cas9基因编辑技术概况 | 第15-22页 |
| 1.5.1 CRISPR-Cas系统的结构与分类 | 第16-19页 |
| 1.5.2 CRISPR-Cas系统作用原理 | 第19-20页 |
| 1.5.3 CRISPR-Cas9应用现状 | 第20-22页 |
| 1.6 Anti-CRISPR-Cas系统 | 第22-24页 |
| 1.7 目的意义 | 第24-25页 |
| 2 材料与方法 | 第25-43页 |
| 2.1 实验材料 | 第25-32页 |
| 2.1.1 菌株、质粒和引物 | 第25-29页 |
| 2.1.2 主要试剂盒 | 第29-30页 |
| 2.1.3 试剂、抗生素和培养基 | 第30-32页 |
| 2.2 实验方法 | 第32-43页 |
| 2.2.1 PCR扩增方法 | 第32-33页 |
| 2.2.2 sgRNA设计和相关引物的合成 | 第33-34页 |
| 2.2.3 DNA酶切 | 第34页 |
| 2.2.4 DNA纯化分离的方法 | 第34-35页 |
| 2.2.5 PCR产物或酶切产物的电泳检测 | 第35页 |
| 2.2.6 酶切后连接及同源重组 | 第35-36页 |
| 2.2.7 感受态的制备 | 第36-37页 |
| 2.2.8 重组产物或质粒转化 | 第37-38页 |
| 2.2.9 质粒提取 | 第38-39页 |
| 2.2.10 布鲁氏菌基因组的提取 | 第39-40页 |
| 2.2.11 布鲁氏菌RNA的抽提 | 第40-41页 |
| 2.2.12 RNA抽提质量检测 | 第41页 |
| 2.2.13 Western blot | 第41-43页 |
| 3 实验结果 | 第43-83页 |
| 3.1 CRISPR-Cas9切割布鲁氏菌基因组效率验证 | 第43-57页 |
| 3.1.1 CRISPR-Cas9载体骨架的构建 | 第43-47页 |
| 3.1.2 CRISPR-Cas9表达载体启动子的选择 | 第47-50页 |
| 3.1.3 CRISPR-Cas9表达质粒构建 | 第50-57页 |
| 3.2 CRISPR-Cas9与HDR技术进行基因敲除 | 第57-79页 |
| 3.2.1 CRISPR-Cas9-single sgRNA与含同源修复序列的非复制型质粒共转化布鲁氏菌 | 第57-62页 |
| 3.2.2 CRISPR-Cas9-dual sgRNA与含同源修复序列的非复制型质粒共转化布鲁氏菌 | 第62-69页 |
| 3.2.3 CRISPR-Cas9基因敲除同源修复自杀质粒转化布鲁氏菌 | 第69-79页 |
| 3.3 CRISPR-Cas9编辑布鲁氏菌基因组过程中产生的‘escapers’现象探究 | 第79-83页 |
| 4 讨论与结论 | 第83-89页 |
| 4.1 CRISPR-Cas9在布鲁氏菌中基因组切割效率验证 | 第83-84页 |
| 4.2 同源重组拯救方案探索 | 第84-87页 |
| 4.3 Anti-CRISPR-Cas系统探索 | 第87-88页 |
| 4.4 结论 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-94页 |
| 致谢 | 第94页 |
