| 摘要 | 第7-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 缩略语表 | 第13-14页 |
| 1 前言 | 第14-40页 |
| 1.1 恶臭假单胞菌KT2440 | 第14-21页 |
| 1.1.1 恶臭假单胞菌KT2440简介 | 第14页 |
| 1.1.2 恶臭假单胞菌KT2440生物被膜的组成及其调控 | 第14-18页 |
| 1.1.3 假单胞菌中鞭毛介导的运动能力及其调控 | 第18-21页 |
| 1.1.4 生物被膜附着状态和运动状态间的转换 | 第21页 |
| 1.2 核苷类第二信使c-di-GMP | 第21-38页 |
| 1.2.1 细菌中的信号传递系统 | 第21-22页 |
| 1.2.2 细菌中的核苷类第二信使分子 | 第22页 |
| 1.2.3 C-di-GMP的发现与发展 | 第22-23页 |
| 1.2.4 C-di-GMP在胞内的代谢 | 第23-26页 |
| 1.2.5 C-di-GMP及其代谢酶的分布 | 第26-27页 |
| 1.2.6 C-di-GMP代谢酶活性调控与信号刺激 | 第27-29页 |
| 1.2.7 C-di-GMP的受体及其对细菌生理代谢活动的调控 | 第29-30页 |
| 1.2.8 铜绿假单胞菌中c-di-GMP调控pel操纵子表达的机理及模型 | 第30-33页 |
| 1.2.9 C-di-GMP和其他信号转导系统的关联 | 第33-36页 |
| 1.2.10 C-di-GMP作用模式的假说 | 第36-37页 |
| 1.2.11 C-di-GMP的应用 | 第37-38页 |
| 1.3 本文的目的与意义 | 第38-40页 |
| 2 材料与方法 | 第40-57页 |
| 2.1 材料 | 第40-44页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第40-42页 |
| 2.1.2 试剂与仪器 | 第42-44页 |
| 2.1.2.1 常用试剂 | 第42页 |
| 2.1.2.2 主要仪器 | 第42页 |
| 2.1.2.3 主要培养基及溶液配制 | 第42-44页 |
| 2.2 方法 | 第44-57页 |
| 2.2.1 菌株培养 | 第44-45页 |
| 2.2.2 常见分子生物学基本操作 | 第45页 |
| 2.2.3 恶臭假单胞菌KT2440基因组DNA提取 | 第45页 |
| 2.2.4 工具载体的构建 | 第45-48页 |
| 2.2.5 通过两亲本接合方法将质粒导入KT2440中 | 第48页 |
| 2.2.6 恶臭假单胞菌KT2440感受态细胞的制备及电转化 | 第48-49页 |
| 2.2.7 恶臭假单胞菌KT2440基因缺失突变体的构建 | 第49-50页 |
| 2.2.8 β-半乳糖苷酶活性的测定 | 第50页 |
| 2.2.9 GFP荧光定量检测 | 第50-51页 |
| 2.2.10 启动子碱基点突变及蛋白质氨基酸点突变的构建 | 第51页 |
| 2.2.11 KT2440胞内c-di-GMP的提取 | 第51页 |
| 2.2.12 HPLC定量分析c-di-GMP | 第51-52页 |
| 2.2.13 表型实验 | 第52-53页 |
| 2.2.13.1 菌落形态观察 | 第52页 |
| 2.2.13.2 菌株游动性观察 | 第52页 |
| 2.2.13.3 生物被膜形成能力检测 | 第52页 |
| 2.2.13.4 刚果红吸附检测 | 第52-53页 |
| 2.2.13.5 透射电子显微镜观察鞭毛 | 第53页 |
| 2.2.14 恶臭假单胞菌KT2440总RNA的抽提 | 第53页 |
| 2.2.15 总RNA反转录 | 第53-54页 |
| 2.2.16 qRT-PCR比较基因表达变化 | 第54页 |
| 2.2.17 基因转录起始位点测定 | 第54页 |
| 2.2.18 SDS-PAGE的银染 | 第54-55页 |
| 2.2.19 BCA法检测蛋白浓度 | 第55页 |
| 2.2.20 EMSA实验 | 第55-57页 |
| 3 结果与分析 | 第57-85页 |
| 3.1 恶臭假单胞菌KT2440中c-di-GMP对生物被膜和游动性的影响 | 第57-61页 |
| 3.1.1 KT2440中含有GGDEF/EAL结构域的蛋白 | 第57-59页 |
| 3.1.2 构建胞内高和低c-di-GMP水平的KT2440菌株 | 第59页 |
| 3.1.3 C-di-GMP水平对KT2440菌株生物被膜和游动性的影响 | 第59-60页 |
| 3.1.4 小结 | 第60-61页 |
| 3.2 KT2440中c-di-GMP通过FleQ调控lapA和bcs的表达 | 第61-67页 |
| 3.2.1 C-di-GMP调控生物被膜基质中的四种成分的编码基因的表达 | 第61-62页 |
| 3.2.2 C-di-GMP通过调节因子FleQ调控lapA和bcs操纵子的表达 | 第62-63页 |
| 3.2.3 FleQ突变体生物被膜形成能力缺损，对c-di-GMP的响应能力下降 | 第63-65页 |
| 3.2.4 FleQ能体外结合lapA和bcs的启动子，且受c-di-GMP影响 | 第65-66页 |
| 3.2.5 小结 | 第66-67页 |
| 3.3 降解酶BifA的表达受sigma因子FliA的调控 | 第67-75页 |
| 3.3.1 在fliA缺失突变体中bifA表达下调 | 第67-69页 |
| 3.3.2 检测bifA基因的转录起始位点 | 第69-70页 |
| 3.3.3 Fli A保守结合序列中碱基突变导致bifA启动子活性下降 | 第70-71页 |
| 3.3.4 超表达FliA导致胞内c-di-GMP水平下降，且依赖BifA的存在 | 第71-72页 |
| 3.3.5 超表达FliA增强野生型菌株的运动性，但对bifA突变体的游动性无影响 | 第72-75页 |
| 3.3.6 小结 | 第75页 |
| 3.4 合成酶GcbA的表达受调节因子FleQ调控，且响应胞内c-di-GMP水平 | 第75-85页 |
| 3.4.1 KT2440中的c-di-GMP合成酶GcbA影响初期生物被膜形成和游动性能力 | 第75-77页 |
| 3.4.2 在fleQ缺失突变体中gcbA表达下降 | 第77-78页 |
| 3.4.3 C-di-GMP通过FleQ调控gcbA的表达 | 第78-79页 |
| 3.4.4 FleQ体外结合gcb A启动子DNA | 第79-80页 |
| 3.4.5 FleN参与FleQ对gcbA表达的调控 | 第80-81页 |
| 3.4.6 RpoN和FleQ的ATP活性影响gcbA的表达 | 第81-84页 |
| 3.4.7 小结 | 第84-85页 |
| 4 讨论与展望 | 第85-91页 |
| 4.1 讨论 | 第85-90页 |
| 4.1.1 调节因子FleQ的功能 | 第85-87页 |
| 4.1.2 GcbA与胞内局部c-di-GMP浓度关联的推测 | 第87页 |
| 4.1.3 C-di-GMP对lapF和pea的调控 | 第87-88页 |
| 4.1.4 Fli A对BifA的调控及作用 | 第88页 |
| 4.1.5 C-di-GMP和其它核苷酸信使之间关系的猜测 | 第88-89页 |
| 4.1.6 实验中的菌株表型衰退现象 | 第89页 |
| 4.1.7 探究外界信号与c-di-GMP代谢蛋白的对应关系的方法 | 第89-90页 |
| 4.2 展望 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-107页 |
| 附录A 本文所用引物 | 第107-109页 |
| 附录B 基因缺失突变体的筛选及验证 | 第109-112页 |
| 附录C 论文发表和待发表情况 | 第112-113页 |
| 致谢 | 第113-114页 |
