| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 1 文献综述 | 第10-16页 |
| 1.1 昆虫先天免疫反应 | 第10-12页 |
| 1.2 昆虫免疫基因的表达调控 | 第12-13页 |
| 1.3 昆虫免疫基因defense的研究进展 | 第13页 |
| 1.4 昆虫免疫基因apolipophorin-Ⅲ的研究进展 | 第13-14页 |
| 1.5 昆虫免疫基因的应用前景 | 第14-16页 |
| 1.5.1 在临床和医药行业上的应用 | 第14页 |
| 1.5.2 在基因工程上的应用 | 第14-15页 |
| 1.5.3 在农业上和畜牧业上的应用 | 第15页 |
| 1.5.4 在食品和化妆品上的应用 | 第15-16页 |
| 2 引言 | 第16-18页 |
| 2.1 研究目的及意义 | 第16页 |
| 2.2 研究内容 | 第16-17页 |
| 2.2.1 柳蚕免疫基因defense和apolipophorin-Ⅲ的克隆 | 第16页 |
| 2.2.2 柳蚕免疫基因defense和apolipophorin-Ⅲ的原核表达及多抗制备 | 第16页 |
| 2.2.3 柳蚕免疫蛋白defense和apolipophorin-Ⅲ的表达模式分析 | 第16页 |
| 2.2.4 柳蚕免疫蛋白defense和apolipophorin-Ⅲ的功能研究 | 第16-17页 |
| 2.3 技术路线 | 第17-18页 |
| 3 材料与方法 | 第18-32页 |
| 3.1 实验材料 | 第18页 |
| 3.2 仪器与试剂 | 第18-21页 |
| 3.2.1 主要实验仪器 | 第18-19页 |
| 3.2.2 主要实验试剂 | 第19页 |
| 3.2.3 常用溶液的配置 | 第19-21页 |
| 3.3 实验方法 | 第21-32页 |
| 3.3.1 基因的克隆 | 第21-26页 |
| 3.3.1.1 实验材料 | 第21页 |
| 3.3.1.2 组织的收集 | 第21页 |
| 3.3.1.3 总RNA的提取 | 第21-22页 |
| 3.3.1.4 总RNA的质量检测 | 第22页 |
| 3.3.1.5 第一链cDNA的合成 | 第22-23页 |
| 3.3.1.6 引物设计和PCR扩增 | 第23-25页 |
| 3.3.1.7 PCR产物的纯化 | 第25-26页 |
| 3.3.1.8 目的片段与pMD-19T的连接 | 第26页 |
| 3.3.2 | 第26-27页 |
| 3.3.2.1 引物设计及PCR特异性扩增(如 3.3.1.6) | 第26页 |
| 3.3.2.2 质粒抽提 | 第26-27页 |
| 3.3.2.3 目的片段和pET-32a(+)的双酶切 | 第27页 |
| 3.3.2.4 连接目的基因和表达载体 | 第27页 |
| 3.3.2.5 重组蛋白诱导表达 | 第27页 |
| 3.3.3 重组蛋白检测及纯化 | 第27-29页 |
| 3.3.3.1 SDS-PAGE电泳检测 | 第27-28页 |
| 3.3.3.2 重组蛋白纯化 | 第28-29页 |
| 3.3.3.2.1 重组蛋白的可溶性分析 | 第28页 |
| 3.3.3.2.2 重组蛋白的纯化 | 第28-29页 |
| 3.3.3.3 Western Blot分析 | 第29页 |
| 3.3.4 | 第29-30页 |
| 3.3.4.1 蛋白定量 | 第29页 |
| 3.3.4.2 多克隆抗体制备 | 第29-30页 |
| 3.3.4.2.1 免疫动物及抗血清的收集 | 第29-30页 |
| 3.3.4.2.2 ELISA测抗体效价 | 第30页 |
| 3.3.5 表达分析 | 第30-31页 |
| 3.3.5.1 组织表达特征 | 第30-31页 |
| 3.3.5.1.1 组织的收集 | 第30页 |
| 3.3.5.1.2 总RNA的提取 | 第30页 |
| 3.3.5.1.3 组织总蛋白的抽取 | 第30-31页 |
| 3.3.5.1.4 RT-PCR分析 | 第31页 |
| 3.3.5.1.5 免疫印迹分析 | 第31页 |
| 3.3.6 抑菌圈实验 | 第31-32页 |
| 4 结果与分析 | 第32-49页 |
| 4.1 柳蚕defense基因的结果与分析 | 第32-41页 |
| 4.1.1 总RNA的检测 | 第32页 |
| 4.1.2 defense基因的RACE-PCR扩增 | 第32页 |
| 4.1.3 Defense基因序列分析 | 第32-36页 |
| 4.1.4 原核表达载体的构建 | 第36页 |
| 4.1.4.1 目的基因的ORF克隆鉴定 | 第36页 |
| 4.1.4.2 双酶切鉴定 | 第36页 |
| 4.1.4.3 菌落PCR鉴定 | 第36页 |
| 4.1.5 重组defense蛋白的表达及纯化 | 第36-38页 |
| 4.1.5.1 SDS-PAGE检测 | 第36-37页 |
| 4.1.5.2 Western blot分析 | 第37页 |
| 4.1.5.3 重组蛋白纯化 | 第37-38页 |
| 4.1.6 多克隆抗体制备 | 第38页 |
| 4.1.6.1 蛋白定量 | 第38页 |
| 4.1.7 defense的表达模式分析 | 第38-40页 |
| 4.1.7.1 defense基因的组织分布 | 第38-39页 |
| 4.1.7.2 不同微生物对defense基因的诱导表达 | 第39-40页 |
| 4.1.8 抑菌实验 | 第40-41页 |
| 4.2 柳蚕Apolipophorin-Ⅲ基因的结果与分析 | 第41-49页 |
| 4.2.1 总RNA的检测 | 第41页 |
| 4.2.2 Apolipophorin-Ⅲ基因的RACE-PCR扩增 | 第41页 |
| 4.2.3 Apolipophorin-Ⅲ基因序列分析 | 第41-44页 |
| 4.2.4 原核表达载体的构建 | 第44页 |
| 4.2.4.1 目的基因的ORF克隆鉴定 | 第44页 |
| 4.2.4.2 双酶切鉴定 | 第44页 |
| 4.2.4.3 菌落PCR鉴定 | 第44页 |
| 4.2.5 重组Apolipophorin-Ⅲ蛋白的表达及纯化 | 第44-46页 |
| 4.2.5.1 SDS-PAGE检测 | 第44-45页 |
| 4.2.5.2 Western blot分析 | 第45页 |
| 4.2.5.3 重组蛋白纯化 | 第45-46页 |
| 4.2.6 多克隆抗体制备 | 第46页 |
| 4.2.6.1 蛋白定量 | 第46页 |
| 4.2.7 Apolipophorin-Ⅲ的表达分析 | 第46-48页 |
| 4.2.7.1 Apolipophorin-Ⅲ基因的组织定量 | 第46-47页 |
| 4.2.7.2 注射四种不同微生物对Apolipophorin-Ⅲ基因表达量影响 | 第47-48页 |
| 4.2.8 RNA干扰 | 第48-49页 |
| 5 结论 | 第49-51页 |
| 5.1 defense结论 | 第49页 |
| 5.2 Apolipophorin-Ⅲ结论 | 第49-51页 |
| 6 讨论与展望 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-58页 |
| 致谢 | 第58-59页 |
| 个人简介 | 第59页 |
| 在研期间发表论文 | 第59页 |
