| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-10页 |
| 第一章 绪论 | 第10-15页 |
| 1 杆状病毒概述 | 第10-12页 |
| ·杆状病毒表达系统概述 | 第10页 |
| ·杆状病毒启动子研究现状 | 第10-11页 |
| ·杆状病毒晚期转录因子研究现状 | 第11-12页 |
| 2 酵母单杂交系统简介 | 第12-13页 |
| 3 EMSA简介 | 第13页 |
| 4 荧光素酶简介 | 第13-14页 |
| 5 Red重组简介 | 第14-15页 |
| 第二章 实验方案 | 第15-17页 |
| 1 研究的目的和意义 | 第15页 |
| 2 研究的主要内容 | 第15-16页 |
| 3 技术路线图 | 第16-17页 |
| 第三章 Bm NPV多角体基因polh启动子序列结合蛋白的筛选 | 第17-35页 |
| 1 实验材料 | 第17-19页 |
| ·菌株和载体 | 第17页 |
| ·试剂 | 第17页 |
| ·其他主要试剂 | 第17-19页 |
| 2 实验方法 | 第19-29页 |
| ·重组诱饵载体构建 | 第19-21页 |
| ·酵母诱饵报告子的构建 | 第21-24页 |
| ·构建c DNA AD融合表达文库（c DNAAD fusion library） | 第24-27页 |
| ·利用酵母单杂交系统筛选多角体基因启动子结合蛋白 | 第27-28页 |
| ·阳性克隆的鉴定并进行测序分析 | 第28-29页 |
| 3 实验结果 | 第29-33页 |
| ·合成目的启动子片段的鉴定 | 第29页 |
| ·重组质粒p MD 18-T-ppolh的鉴定 | 第29-30页 |
| ·重组质粒ppolh-Ab Ai鉴定 | 第30页 |
| ·酵母单杂交系统筛选c DNA文库的构建 | 第30-31页 |
| ·酵母诱饵报告子的PCR鉴定 | 第31页 |
| ·酵母诱饵报告子的Ab Ar抗性测定 | 第31-32页 |
| ·c DNAAD融合表达文库进行筛选 | 第32页 |
| ·家蚕细胞c DNA文库的筛选 | 第32-33页 |
| 4 讨论 | 第33-35页 |
| 第四章 蛋白结合因子的生物信息学分析 | 第35-40页 |
| 1 生物信息学工具 | 第35页 |
| 2 lef5基因、orf61基因和p6.9 基因的生物信息学分析 | 第35-39页 |
| ·lef5基因、orf61基因和p6.9 基因的序列分析 | 第35-37页 |
| ·疏水性分析 | 第37页 |
| ·信号肽分析 | 第37页 |
| ·跨膜区分析 | 第37-38页 |
| ·二级结构预测 | 第38-39页 |
| 3 讨论 | 第39-40页 |
| 第五章 结合蛋白的EMSA分析 | 第40-48页 |
| 1 材料与试剂 | 第40页 |
| ·材料 | 第40页 |
| ·试剂 | 第40页 |
| ·试剂的配置 | 第40页 |
| 2 方法 | 第40-45页 |
| ·生物素标记的探针制备 | 第42页 |
| ·EMSA实验 | 第42-45页 |
| 3 实验结果 | 第45-47页 |
| ·载体构建结果 | 第45页 |
| ·蛋白纯化浓缩结果 | 第45-46页 |
| ·EMSA结果 | 第46-47页 |
| 4 讨论 | 第47-48页 |
| 第六章 结合蛋白基因的瞬时表达分析 | 第48-53页 |
| 1 材料与试剂 | 第48页 |
| ·材料 | 第48页 |
| ·试剂 | 第48页 |
| 2 方法 | 第48-50页 |
| ·瞬时表达载体p IE1-lef5、p IE1-orf61和p IE1-p6.9 的构建 | 第48-49页 |
| ·瞬时表达质粒转染家蚕Bm N细胞 | 第49页 |
| ·家蚕Bm N细胞的感染 | 第49页 |
| ·萤火虫荧光素酶活性的检测 | 第49-50页 |
| 3 结论 | 第50-52页 |
| ·PCR扩增目的基因lef5、orf61和p6.9 | 第50页 |
| ·重组质粒p IE1-lef5、p IE1-orf61和p IE1-p6.9 的鉴定 | 第50-51页 |
| ·基因的瞬时表达结果分析 | 第51-52页 |
| 4 讨论 | 第52-53页 |
| 第七章 结合蛋白基因功能分析 | 第53-69页 |
| 1 材料与试剂 | 第53页 |
| ·材料 | 第53页 |
| ·试剂 | 第53页 |
| ·试剂配置 | 第53页 |
| 2 方法 | 第53-56页 |
| ·制作敲除型感受态细胞 | 第53-54页 |
| ·Bm NPV lef5、orf61和p6.9 敲除片段的制备 | 第54页 |
| ·lef5、orf61和p6.9 三种基因的敲除病毒构建 | 第54页 |
| ·lef5、orf61和p6.9 基因缺失型Bacmid的PCR鉴定 | 第54页 |
| ·构建转移载体p Fast Bac Dul-luc-lef5、p Fast Bac Dul-luc-orf61和p Fast Bac Dul-luc-p6.9 | 第54-55页 |
| ·基因补回型病毒的构建 | 第55-56页 |
| ·基因补回型病毒的PCR鉴定 | 第56页 |
| 3 lef5、orf61和p6.9 缺失对Bm NPV基因组DNA复制的影响 | 第56-59页 |
| ·家蚕细胞复苏、培养和冻存 | 第56页 |
| ·提取病毒Bacmid | 第56-57页 |
| ·Bacmid转染Bm N细胞 | 第57页 |
| ·病毒滴度的测定 | 第57-58页 |
| ·不同时间点病毒基因组的提取和消化 | 第58页 |
| ·gp41荧光定量PCR分析 | 第58-59页 |
| 4 缺失对Bm NPV病毒早期、晚期和极晚期基因转录的影响 | 第59-60页 |
| ·荧光定量PCR引物的设计 | 第59页 |
| ·脂质体介导三种病毒基因组DNA转染家蚕Bm N细胞 | 第59页 |
| ·细胞总RNA的提取及c DNA第一链的合成 | 第59页 |
| ·荧光定量PCR | 第59-60页 |
| ·荧光定量PCR数据的分析 | 第60页 |
| 5 实验结果与分析 | 第60-67页 |
| ·缺陷型病毒鉴定 | 第60-61页 |
| ·补回型病毒鉴定 | 第61页 |
| ·病毒增殖曲线分析 | 第61-62页 |
| ·缺失对病毒复制的影响 | 第62-64页 |
| ·三种病毒早期基因lef3转录的q PCR分析 | 第64-65页 |
| ·三种病毒晚期基因vp39转录的q PCR分析 | 第65-66页 |
| ·病毒极晚期基因p10转录的q PCR分析 | 第66-67页 |
| 6 讨论 | 第67-69页 |
| 结论 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-75页 |
| 附录 | 第75-77页 |
| 致谢 | 第77页 |
