脂肪酶活性中心区域进化提高酶动力学稳定性和催化活性
| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-14页 |
| 第一章 前言 | 第14-40页 |
| ·酶稳定性简介 | 第14-15页 |
| ·影响酶稳定性的因素 | 第15-23页 |
| ·氢键 | 第16页 |
| ·盐桥 | 第16-17页 |
| ·疏水相互作用 | 第17页 |
| ·二硫键 | 第17-18页 |
| ·芳香环相互作用 | 第18页 |
| ·氨基酸的组成 | 第18-21页 |
| ·稳定的二级结构 | 第21页 |
| ·蛋白质的包装效率 | 第21-22页 |
| ·不稳定区域的锚定 | 第22页 |
| ·亚基间的相互作用和寡聚作用 | 第22-23页 |
| ·翻译后修饰 | 第23页 |
| ·金属离子的结合 | 第23页 |
| ·酶稳定性改造的策略和研究进展 | 第23-30页 |
| ·理性设计提升酶稳定性 | 第24-25页 |
| ·非理性设计提升酶稳定性 | 第25-27页 |
| ·半理性设计提升酶稳定性 | 第27-30页 |
| ·B 因子简介 | 第30-32页 |
| ·酶活性中心简介 | 第32-34页 |
| ·酶活性中心改造 | 第32-33页 |
| ·酶活性中心的柔性 | 第33-34页 |
| ·南极假丝酵母脂肪酶 B 简介 | 第34-37页 |
| ·立题依据 | 第37-40页 |
| 第二章 CalB 在大肠杆菌中的高效表达 | 第40-60页 |
| ·引言 | 第40-41页 |
| ·材料和试剂 | 第41-43页 |
| ·菌株和质粒 | 第41页 |
| ·主要试剂 | 第41-42页 |
| ·主要仪器 | 第42页 |
| ·培养基 | 第42页 |
| ·溶液配制 | 第42-43页 |
| ·实验方法 | 第43-50页 |
| ·CalB 基因的 PCR 扩增及纯化 | 第43-44页 |
| ·重组质粒的构建及转化 | 第44-47页 |
| ·阳性克隆的鉴定和表达 | 第47-49页 |
| ·活力染色 | 第49页 |
| ·CalB 的纯化 | 第49-50页 |
| ·CalB 的活力检测 | 第50页 |
| ·结果与分析 | 第50-58页 |
| ·目的基因的 PCR 扩增 | 第50-52页 |
| ·重组质粒的构建 | 第52页 |
| ·目的蛋白质的表达与纯化 | 第52-57页 |
| ·重组 CalB 的活力染色 | 第57-58页 |
| ·重组 CalB 的纯化 | 第58页 |
| ·小结 | 第58-60页 |
| 第三章 酶活性中心突变有效提升酶定性 | 第60-94页 |
| ·前言 | 第60-61页 |
| ·仪器与试剂 | 第61页 |
| ·主要仪器 | 第61页 |
| ·主要试剂 | 第61页 |
| ·实验方法 | 第61-69页 |
| ·氨基酸的 B 因子分析及靶标位点的确定 | 第61页 |
| ·迭代饱和突变库的构建和筛选 | 第61-65页 |
| ·基本酶学性质的表征 | 第65-66页 |
| ·酶动力学稳定性表征 | 第66-67页 |
| ·酶热力学稳定性表征 | 第67-69页 |
| ·结果与分析 | 第69-92页 |
| ·迭代饱和突变库的构建和筛选 | 第69-77页 |
| ·靶标位点的选择 | 第69-71页 |
| ·饱和突变库的构建和筛选 | 第71-73页 |
| ·饱和突变库筛选的准确性 | 第73-74页 |
| ·迭代饱和突变库的构建和筛选 | 第74-75页 |
| ·突变对酶活性的影响 | 第75-77页 |
| ·基本酶学性质表征 | 第77-83页 |
| ·温度对酶活性的影响 | 第77页 |
| ·pH 对酶活性的影响 | 第77-78页 |
| ·酶的底物选择性 | 第78-80页 |
| ·酶活化过程的研究 | 第80-83页 |
| ·酶动力学稳定性研究 | 第83-88页 |
| ·酶失活动力学研究 | 第83-84页 |
| ·温度诱导的酶失活 | 第84-85页 |
| ·尿素诱导的酶失活 | 第85-86页 |
| ·酶在有机溶剂中的稳定性 | 第86-88页 |
| ·酶热力学稳定性研究 | 第88-92页 |
| ·DSC/DSF 研究酶的热解折叠 | 第88-90页 |
| ·尿素诱导酶的解折叠 | 第90-92页 |
| ·小结 | 第92-94页 |
| 第四章 突变体的稳定性机理研究 | 第94-116页 |
| ·前言 | 第94页 |
| ·材料与方法 | 第94-95页 |
| ·软件及仪器 | 第94页 |
| ·试剂盒 | 第94-95页 |
| ·实验方法 | 第95-96页 |
| ·蛋白质样品的制备 | 第95页 |
| ·结晶条件的筛选 | 第95页 |
| ·晶体的 X-ray 衍射及信号收集 | 第95页 |
| ·分子动力学模拟 | 第95-96页 |
| ·结果与分析 | 第96-114页 |
| ·蛋白质样品的制备 | 第96-97页 |
| ·蛋白质结晶的生长 | 第97-98页 |
| ·晶体数据的收集 | 第98-101页 |
| ·晶体结构的分析 | 第101-109页 |
| ·分子动力学模拟 | 第109-114页 |
| ·小结 | 第114-116页 |
| 第五章 活性中心突变对酶活力的再进化 | 第116-128页 |
| ·前言 | 第116页 |
| ·材料与方法 | 第116-118页 |
| ·数据库及软件 | 第116-117页 |
| ·分子对接 | 第117页 |
| ·饱和突变库的构建和筛选 | 第117-118页 |
| ·组合突变 | 第118页 |
| ·突变体基本酶学性质的表征 | 第118页 |
| ·同源建模 | 第118页 |
| ·结果与分析 | 第118-126页 |
| ·受体和配体的准备 | 第118-119页 |
| ·Autodock Vina 分子对接 | 第119-121页 |
| ·饱和突变库的筛选及酶学性质表征 | 第121-123页 |
| ·突变体的同源建模 | 第123-125页 |
| ·突变位点的组合 | 第125-126页 |
| ·小结 | 第126-128页 |
| 创新点 | 第128-130页 |
| 展望 | 第130-132页 |
| 作者简介 | 第132-133页 |
| 参与的科研课题 | 第133-134页 |
| 致谢 | 第134-136页 |
| 参考文献 | 第136-147页 |
