| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 缩略语对照表 | 第9-15页 |
| 第1章 前言 | 第15-29页 |
| ·甾体药物与甾型抗生素 | 第15-21页 |
| ·甾体化合物、甾体药物与甾型抗生素 | 第15-16页 |
| ·甾型抗生素 | 第16-17页 |
| ·产烟曲霉酸真菌烟曲霉和金龟子绿僵菌 | 第17-20页 |
| ·烟曲霉(Aspergillus fumigatus) | 第17-18页 |
| ·金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae) | 第18页 |
| ·产甾型抗生素的丝状真菌对甾体药物的生物转化作用 | 第18-20页 |
| ·烟曲霉酸的生物合成机制与合成基因簇 | 第20-21页 |
| ·甾型抗生素的后修饰反应在甾体转化方面潜在的价值 | 第21页 |
| ·甾体药物的微生物转化 | 第21-27页 |
| ·微生物转化在甾体药物制备中的重要地位 | 第21-22页 |
| ·甾体微生物转化反应 | 第22-24页 |
| ·甾体微生物转化类型 | 第22-23页 |
| ·重要甾体微生物转化反应举例 | 第23-24页 |
| ·3-甾酮-Δ~1-脱氢酶(3-keto-Δ~1-dehydrogenase,KsdD)对甾体C1,2位的转化作用及其工业应用 | 第24-27页 |
| ·3-甾酮-Δ~1-脱氢酶的简介 | 第24-25页 |
| ·3-甾酮-Δ~1-脱氢酶的催化机理 | 第25页 |
| ·3-甾酮-Δ~1-脱氢酶的异源表达 | 第25-26页 |
| ·雄甾-4-烯-3,17-二酮和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的研究进展 | 第26-27页 |
| ·本课题的研究目的与内容 | 第27-29页 |
| 第2章 金龟子绿僵菌基因簇的获取和基因功能分析 | 第29-38页 |
| ·引言 | 第29页 |
| ·实验材料 | 第29-31页 |
| ·菌株与载体 | 第29页 |
| ·培养基及实验试剂 | 第29-30页 |
| ·培养基 | 第29页 |
| ·生化与分子生物学试剂 | 第29-30页 |
| ·主要化学试剂 | 第30页 |
| ·常用溶液的配制 | 第30页 |
| ·菌种保藏 | 第30页 |
| ·主要仪器 | 第30-31页 |
| ·主要引物 | 第31页 |
| ·实验方法 | 第31-33页 |
| ·金龟子绿僵菌基因组的提取 | 第31-32页 |
| ·基因文库的构建 | 第32页 |
| ·基因簇的钓取 | 第32-33页 |
| ·基因文库中大肠杆菌的培养 | 第32页 |
| ·克隆的鉴定 | 第32-33页 |
| ·阳性克隆的测序和序列拼接 | 第33页 |
| ·基因簇全长的获得 | 第33页 |
| ·结果与分析 | 第33-36页 |
| ·金龟子绿僵菌基因组的获得 | 第33页 |
| ·基因簇的钓取 | 第33-34页 |
| ·基因簇完整序列的获取 | 第34-35页 |
| ·基因簇基因功能的推测以及与烟曲霉基因簇基因的比较 | 第35-36页 |
| ·本章小结 | 第36-38页 |
| 第3章 农杆菌介导的烟曲霉P450基因敲除 | 第38-50页 |
| ·引言 | 第38页 |
| ·实验材料 | 第38-40页 |
| ·菌株与材料 | 第38页 |
| ·培养基及实验试剂 | 第38-39页 |
| ·培养基 | 第38-39页 |
| ·实验试剂 | 第39页 |
| ·主要仪器 | 第39页 |
| ·主要引物 | 第39-40页 |
| ·实验方法 | 第40-45页 |
| ·烟曲霉基因组的提取 | 第40页 |
| ·农杆菌介导质粒的构建 | 第40-43页 |
| ·烟曲霉P450(Af4g14780)基因片段的克隆 | 第40页 |
| ·PCR产物的纯化与回收 | 第40-41页 |
| ·pPK2质粒的提取 | 第41页 |
| ·P450基因片段RB’与pPK2载体的双酶切 | 第41页 |
| ·RB’与pPK2载体的连接 | 第41-42页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第42页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌 | 第42页 |
| ·阳性重组子的菌落PCR鉴定 | 第42页 |
| ·阳性重组子的序列分析 | 第42页 |
| ·含RB’阳性重组子的质粒提取 | 第42-43页 |
| ·P450 LB’基因的克隆 | 第43页 |
| ·阳性重组子与LB’的连接及验证 | 第43页 |
| ·根癌农杆菌感受态细胞的制备 | 第43页 |
| ·电转法转化RB’/LB’::pPK2入农杆菌GV3101感受态 | 第43页 |
| ·烟曲霉孢子的获取 | 第43页 |
| ·根癌农杆菌介导的转化 | 第43-44页 |
| ·转化子的鉴定 | 第44页 |
| ·烟曲霉P450敲除株产烟曲霉酸能力的检测 | 第44-45页 |
| ·烟曲霉的培养和发酵产物的萃取 | 第44页 |
| ·转化反应的HPLC分析 | 第44-45页 |
| ·结果与分析 | 第45-48页 |
| ·PCR扩增RB’和LB’ | 第45页 |
| ·构建RB’/LB’::pPK2载体 | 第45-47页 |
| ·转化子的鉴定 | 第47页 |
| ·烟曲霉P450敲除株产烟曲霉酸能力的检测 | 第47-48页 |
| ·本章小结 | 第48-50页 |
| 第4章 烟曲霉3-甾酮-Δ~1-脱氢酶的异源表达以及高效转化AD的基因工程菌构建 | 第50-84页 |
| ·引言 | 第50页 |
| ·实验材料 | 第50-52页 |
| ·菌株与载体 | 第50页 |
| ·培养基和实验材料 | 第50-51页 |
| ·培养基 | 第50-51页 |
| ·实验试剂 | 第51页 |
| ·主要仪器 | 第51页 |
| ·主要引物 | 第51-52页 |
| ·实验方法 | 第52-61页 |
| ·3-甾酮-Δ~1-脱氢酶(ksdD_F)在大肠杆菌(E.coli)中的表达基因的获取 | 第52-53页 |
| ·烟曲霉基因组的提取 | 第52页 |
| ·PCR扩增目的基因 | 第52页 |
| ·PCR产物的纯化与回收 | 第52页 |
| ·pET28(a)质粒的提取 | 第52页 |
| ·PCR产物与pET28(a)载体的双酶切 | 第52-53页 |
| ·目的基因与pET28(a)载体的连接 | 第53页 |
| ·大肠杆菌DH5α或BL21(λDE3)感受态细胞的制备 | 第53页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌DH5a | 第53页 |
| ·阳性重组子的菌落PCR鉴定 | 第53页 |
| ·阳性重组子的序列分析 | 第53页 |
| ·重组质粒转化大肠杆菌BL21(λDE3) | 第53页 |
| ·阳性重组子的菌落PCR鉴定 | 第53页 |
| ·KsdD_F跨膜结构的预测 | 第53页 |
| ·3-甾酮-Δ~1-脱氢酶(ksdD_F)在大肠杆菌(E.coli)中的诱导表达 | 第53-56页 |
| ·重组KsdD_F的诱导表达 | 第53-54页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE电泳鉴定 | 第54页 |
| ·KsdD_F重组大肠杆菌的全细胞转化反应 | 第54-55页 |
| ·ksdD_F重组大肠杆菌各细胞组分的酶活测定以及KsdD_F的酶活定位 | 第55页 |
| ·KsdD_F大肠杆菌表达酶动力学参数的测定 | 第55-56页 |
| ·重组毕赤酵母KM71(pPIC3.5K-ksdD_F)和GS115(pPIC3.5K-ksdD_F)的构建 | 第56-58页 |
| ·PCR引物的设计与合成 | 第56页 |
| ·PCR扩增目的DNA | 第56页 |
| ·PCR产物的纯化与回收 | 第56页 |
| ·pPIC3.5K质粒的提取 | 第56页 |
| ·PCR产物与pPIC3.5K载体的双酶切 | 第56页 |
| ·目的基因与pPIC3.5K载体的连接 | 第56页 |
| ·大肠杆菌DH5α或BL21(λDE3)感受态细胞的制备 | 第56-57页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第57页 |
| ·阳性重组子的菌落PCR鉴定 | 第57页 |
| ·阳性重组子的序列分析 | 第57页 |
| ·毕赤酵母KM71和GS115感受态细胞的制备和电转化构建 | 第57页 |
| ·重组毕赤酵母的PCR鉴定以及阳性克隆子的基因型鉴定 | 第57-58页 |
| ·毕赤酵母的诱导表达 | 第58-60页 |
| ·生长曲线的测定 | 第58页 |
| ·毕赤酵母的诱导表达 | 第58页 |
| ·目的蛋白的电泳检测 | 第58页 |
| ·工程菌的酶活检测 | 第58-59页 |
| ·诱导条件的优化实验 | 第59页 |
| ·工程菌最高转化能力的检测 | 第59页 |
| ·ksdD_F重组毕赤酵母KM71_I和GS115_I各细胞组分的酶活测定以及KsdD_F的酶活定位 | 第59页 |
| ·毕赤酵母表达KsdD_F酶动力学参数的测定 | 第59-60页 |
| ·毕赤酵母高产菌株GS115_I积累宝丹酮的优化 | 第60页 |
| ·重组毕赤酵母KM71(pPIC9K-ksdD_F)和GS115(pPIC9K-ksdD_F)的构建 | 第60-61页 |
| ·重组载体pPIC3.5K-ksdD_F和pPIC9K质粒的提取 | 第60-61页 |
| ·重组载体pPIC3.5K-ksdD_F与pPIC9K载体的双酶切 | 第61页 |
| ·目的基因与pPIC9K载体的连接 | 第61页 |
| ·重组毕赤酵母KM71(pPIC9K-ksdD_F)和GS115(pPIC9K-ksdD_F)的构建 | 第61页 |
| ·毕赤酵母胞外表达的蛋白电泳和酶活检测 | 第61页 |
| ·毕赤酵母胞外表达的蛋白电泳 | 第61页 |
| ·毕赤酵母胞外表达重组KM71_E和GS115_E的酶活测定 | 第61页 |
| ·结果与分析 | 第61-82页 |
| ·3-甾酮-Δ~1-脱氢酶(ksdD_F)在大肠杆菌(E.coli)中的表达基因的获取 | 第61-65页 |
| ·烟曲霉ksdD_F的克隆 | 第61-62页 |
| ·KsdD_F跨膜结构的预测 | 第62-63页 |
| ·在大肠杆菌中异源表达KsdD_F | 第63-65页 |
| ·ksdD_F的诱导表达及甾体药物转化活性 | 第65-68页 |
| ·ksdD_F的诱导表达 | 第65-66页 |
| ·BL21-pET28a-ksdD_F对AD的全细胞转化 | 第66页 |
| ·细胞中KsdD_F的酶活定位分析 | 第66-67页 |
| ·大肠杆菌表达的KsdD_F酶动力学参数的测定 | 第67-68页 |
| ·重组毕赤酵母KM71(pPIC3.5K-ksdD_F)和GS115(pPIC3.5K-ksdD_F)的构建 | 第68-69页 |
| ·烟曲霉ksdD_F基因的克隆 | 第68页 |
| ·构建ksdD_F::pPIC3.5K载体及毕赤酵母转化 | 第68-69页 |
| ·KsdD_F在毕赤酵母中的胞内表达 | 第69-80页 |
| ·生长曲线的测定 | 第69-70页 |
| ·毕赤酵母的诱导表达及目的蛋白的电泳检测 | 第70页 |
| ·诱导条件的优化实验 | 第70-71页 |
| ·转化能力检测 | 第71-73页 |
| ·KM71_I和GS115_I转化AD生成BD的鉴定 | 第73-77页 |
| ·KsdD_F在KM71_I和GS115_I中的酶活定位 | 第77-78页 |
| ·毕赤酵母表达KsdD_F酶学动力学参数的测定 | 第78-80页 |
| ·ksdD_F在KM71(pPIC9K-ksdD_F)和GS115(pPIC9K-ksdD_F)中的胞外表达 | 第80-81页 |
| ·ksdDF::pPIC9K载体的构建 | 第80页 |
| ·毕赤酵母电转化 | 第80-81页 |
| ·KsdD_F毕赤酵母的胞外表达 | 第81-82页 |
| ·毕赤酵母的诱导表达及目的蛋白的电泳检测 | 第81页 |
| ·重组KM71_E和GS115_E酶活的检测 | 第81-82页 |
| ·本章小结 | 第82-84页 |
| 第5章 结论与展望 | 第84-86页 |
| ·结论 | 第84-85页 |
| ·课题展望 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-91页 |
| 致谢 | 第91页 |
