| 摘要 | 第1-13页 |
| ABSTRACT | 第13-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-55页 |
| 第一部分 | 第19-35页 |
| 1 小菜蛾对不同药剂抗性概况 | 第19-22页 |
| ·小菜蛾分布与危害 | 第19页 |
| ·小菜蛾对不同药剂抗性 | 第19-22页 |
| 2 氟虫腈研究概况 | 第22-30页 |
| ·氟虫腈作用机理 | 第25-27页 |
| ·氟虫腈抗性现状及抗性机理研究进展 | 第27-30页 |
| 3 昆虫GABA受体的研究进展 | 第30-35页 |
| ·GABA受体的分子结构 | 第30-31页 |
| ·GABA受体的分子生物学 | 第31-34页 |
| ·GABA受体与昆虫抗药性 | 第34-35页 |
| 第二部分 | 第35-55页 |
| 1 棉铃虫对拟除虫菊酯抗性概况 | 第35-38页 |
| ·棉铃虫分布与危害 | 第35-36页 |
| ·拟除虫菊酯类药剂概况 | 第36页 |
| ·不同地理种群对拟除虫菊酯药剂的抗性 | 第36-38页 |
| 2 棉铃虫对拟除虫菊酯抗性机制研究 | 第38-44页 |
| ·表皮穿透能力的降低 | 第38-39页 |
| ·神经靶标敏感性的降低 | 第39-40页 |
| ·解毒代谢能力的增强 | 第40-44页 |
| 3 酯酶概况 | 第44-50页 |
| ·酯酶的分类与命名 | 第44-45页 |
| ·酯酶水解酯键的机制 | 第45-46页 |
| ·酯酶介导的代谢抗性机制 | 第46-50页 |
| 4 杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统 | 第50-51页 |
| 5 Gateway~(TM)技术概况 | 第51-55页 |
| 第一篇 小菜蛾GABA受体基因克隆 | 第55-97页 |
| 第二章 小菜蛾GABA受体基因cDNA全长的克隆及序列分析 | 第55-75页 |
| 1 材料与方法 | 第56-67页 |
| ·供试昆虫 | 第56-57页 |
| ·主要试剂 | 第57页 |
| ·主要仪器设备 | 第57页 |
| ·小菜蛾总RNA的提取 | 第57-58页 |
| ·琼脂糖凝胶检测总RNA | 第58页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第58页 |
| ·引物设计及小菜蛾GABA受体cDNA片段的扩增、克隆、测序 | 第58-60页 |
| ·PCR产物回收与纯化 | 第60页 |
| ·连接反应 | 第60-61页 |
| ·连接产物的转化及扩大培养 | 第61页 |
| ·重组质粒的提取及酶切检测 | 第61-62页 |
| ·序列测定与分析 | 第62页 |
| ·采用RACE技术克隆GABA受体cDNA全长 | 第62-67页 |
| ·设计引物验证全长基因的正确性 | 第67页 |
| 2 结果与分析 | 第67-72页 |
| ·目标目标片段的获得 | 第67页 |
| ·RACE技术获得GABA受体基因的cDNA序列全长 | 第67-68页 |
| ·非编码区引物验证基因的正确性 | 第68页 |
| ·小菜蛾GABA受体基因全序列分析 | 第68-72页 |
| 3 讨论 | 第72-75页 |
| ·小菜蛾GABA受体亚基的多样性 | 第72页 |
| ·小菜蛾GABA受体亚基的可变剪接 | 第72-74页 |
| ·小菜蛾GABA受体亚基的突变与氟虫腈抗性 | 第74-75页 |
| 第三章 小菜蛾GABA受体亚基基因组结构及其基因定位 | 第75-85页 |
| 1 材料与方法 | 第76-79页 |
| ·供试昆虫 | 第76页 |
| ·主要试剂及仪器 | 第76页 |
| ·小菜蛾基因组DNA的提取 | 第76-77页 |
| ·GenomeWalker模板的制备 | 第77页 |
| ·小菜蛾PxGABARα1和PxGABARα2亚基基因组序列的获得 | 第77页 |
| ·小菜蛾PxGABARα1和PxGABARα2的基因定位实验 | 第77-78页 |
| ·PCR反应 | 第78-79页 |
| ·PCR产物凝胶电泳检测及测序 | 第79页 |
| 2 结果与分析 | 第79-82页 |
| ·小菜蛾PxGABARα1和PxGABARα2亚基基因组序列的获得 | 第79-80页 |
| ·小菜蛾PxGABARα1的基因定位 | 第80-81页 |
| ·小菜蛾PxGABARα2的基因定位 | 第81-82页 |
| 3 讨论 | 第82-85页 |
| ·小菜蛾PxGABARα1与PxGABARα2亚基的基因组结构 | 第82-83页 |
| ·小菜蛾PxGABARα1与PxGABARα2的基因定位 | 第83-85页 |
| 第四章 小菜蛾PxGABARα1亚基A282S突变与狄氏剂及氟虫腈抗性关系 | 第85-97页 |
| 1 材料与方法 | 第86-90页 |
| ·供试昆虫 | 第86-87页 |
| ·供试药剂 | 第87页 |
| ·抗性品系的筛选、生物测定及杂交实验设计 | 第87-88页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第88页 |
| ·小菜蛾PxGABARα1基因突变PASA及PCR产物直接测序检测 | 第88-90页 |
| 2 结果与分析 | 第90-95页 |
| ·小菜蛾不同品系的交互抗性 | 第90-91页 |
| ·小菜蛾PxGABARα1基因A282S突变在抗性中的作用 | 第91页 |
| ·小菜蛾狄氏剂抗性纯化品系的正反交实验 | 第91-93页 |
| ·小菜蛾PxGABARα1基因A282S突变PASA检测 | 第93-94页 |
| ·PCR产物直接测序检测PxGABARα1基因A282S突变 | 第94-95页 |
| 3 讨论 | 第95-97页 |
| ·Rdl突变及其导致的交互抗性 | 第95页 |
| ·Rdl突变在狄氏剂和氟虫腈抗性中的作用及抗性的性连锁 | 第95-97页 |
| 第二篇 棉铃虫羧酸酯酶的功能表达 | 第97-147页 |
| 第五章 棉铃虫羧酸酯酶基因在昆虫细胞中的异源表达 | 第97-123页 |
| 1 材料与方法 | 第98-109页 |
| ·供试昆虫 | 第98-99页 |
| ·主要试剂及仪器 | 第99页 |
| ·棉铃虫总RNA提取及第一链cDNA合成 | 第99-100页 |
| ·引物设计 | 第100页 |
| ·PCR扩增、产物的凝胶回收 | 第100-102页 |
| ·BP重组反应 | 第102页 |
| ·转化反应 | 第102-103页 |
| ·单克隆挑选及扩大培养 | 第103页 |
| ·质粒DNA提取及测序 | 第103-104页 |
| ·LR重组反应 | 第104页 |
| ·昆虫细胞的培养、转染及病毒扩增 | 第104-106页 |
| ·重组病毒酯酶活性初步检测 | 第106-107页 |
| ·病毒滴度的测定 | 第107-108页 |
| ·棉铃虫羧酸酯酶重组蛋白的获得 | 第108-109页 |
| 2 结果与分析 | 第109-120页 |
| ·序列分析 | 第109-116页 |
| ·重组病毒酯酶活性分析 | 第116-117页 |
| ·实时荧光定量PCR产物熔解曲线、标准曲线及病毒滴度 | 第117-120页 |
| 3 讨论 | 第120-123页 |
| ·棉铃虫拟除虫菊酯抗性机理的研究 | 第120-121页 |
| ·酯酶同工酶与抗性关系的研究 | 第121-123页 |
| 第六章 棉铃虫羧酸酯酶重组蛋白有机磷水解活性及羧酸酯酶活性的测定 | 第123-133页 |
| 1 材料与方法 | 第124-127页 |
| ·棉铃虫羧酸酯酶重组蛋白 | 第124页 |
| ·主要仪器及试剂 | 第124页 |
| ·重组酶蛋白的定量及其有机磷水解活性分析 | 第124-126页 |
| ·重组蛋白酯酶活性的测定 | 第126-127页 |
| 2 结果与分析 | 第127-131页 |
| ·重组酶蛋白浓度测定 | 第127页 |
| ·重组酶蛋白有机磷水解活性测定 | 第127-128页 |
| ·重组酶蛋白以α-NA为底物的动力学分析 | 第128-131页 |
| ·重组酶蛋白以p-NPA为底物的动力学分析 | 第131页 |
| 3 讨论 | 第131-133页 |
| 第七章 棉铃虫羧酸酯酶重组蛋白对拟除虫菊酯及其荧光类似物的代谢 | 第133-147页 |
| 1 材料与方法 | 第134-137页 |
| ·棉铃虫羧酸酯酶重组蛋白 | 第134页 |
| ·主要仪器及试剂 | 第134页 |
| ·棉铃虫羧酸酯酶重组蛋白对拟除虫菊酯荧光类似物的水解 | 第134-136页 |
| ·棉铃虫羧酸酯酶重组蛋白对拟除虫菊酯各立体异构体的代谢 | 第136-137页 |
| 2 结果与分析 | 第137-145页 |
| ·棉铃虫羧酸酯酶重组蛋白对氯氰菊酯荧光类似物的水解 | 第137页 |
| ·棉铃虫羧酸酯酶重组蛋白对氰戊菊酯荧光类似物的水解 | 第137-138页 |
| ·棉铃虫羧酸酯酶重组蛋白对拟除虫菊酯的水解 | 第138-145页 |
| 3 讨论 | 第145-147页 |
| 全文总结 | 第147-149页 |
| 参考文献 | 第149-177页 |
| 附录 | 第177-189页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第189-191页 |
| 致谢 | 第191页 |
