| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-23页 |
| ·研究背景 | 第11页 |
| ·糖尿病的发病机理及目前用于治疗糖尿病的药物 | 第11-14页 |
| ·糖尿病的发病机理 | 第11-13页 |
| ·目前用于治疗糖尿病药物的研究进展 | 第13-14页 |
| ·胰高血糖素样肽-1 | 第14-20页 |
| ·GLP-1 的合成和分泌 | 第14-16页 |
| ·GLP-1 的结构与生理功能 | 第16-17页 |
| ·GLP-1 的受体研究进展 | 第17-18页 |
| ·GLP-1 的临床应用及其局限性 | 第18-19页 |
| ·GLP-1 长效性研究 | 第19-20页 |
| ·白蛋白融合技术 | 第20-22页 |
| ·本论文的研究意义和主要研容 | 第22-23页 |
| 第二章 GLP-1 及GLP-1 突变体在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达 | 第23-35页 |
| ·材料与方法 | 第24-28页 |
| ·菌种和质粒 | 第24页 |
| ·培养基 | 第24页 |
| ·工具酶 | 第24页 |
| ·试剂 | 第24页 |
| ·主要仪器 | 第24-25页 |
| ·引物 | 第25页 |
| ·GLP-1 的串联体基因的合成 | 第25页 |
| ·重组表达质粒pGEX-4T-1-GLP-1 或pGEX-4T-1-GLP-1A2G 的构建与鉴定 | 第25-28页 |
| ·融合蛋白GST-GLP-1 和GST-GLP-1A2G 的诱导表达和纯化[79] | 第28页 |
| ·GLP-1 和GLP-1A2G 蛋白的纯化[80] | 第28页 |
| ·GLP-1 及GLP-1A2G 蛋白的生物活性测定[50] | 第28页 |
| ·结果与讨论 | 第28-34页 |
| ·GLP-1 与 GLP-1A2G 的基因扩增 | 第28-29页 |
| ·表达质粒pGEX-4T-1-GLP-1 和pGEX-4T -1-GLP-1A2G 的构建流程 | 第29-31页 |
| ·表达质粒pGEX-4T -1-GLP-1 和pGEX-4T -1-GLP-1A2G 的基因测序 | 第31页 |
| ·融合蛋白GST-GLP-1 和GST-GLP-1A2G 的诱导表达和纯化 | 第31-33页 |
| ·GLP-1 及GLP-1A2G 的生物活性测定 | 第33-34页 |
| ·本章结论 | 第34-35页 |
| 第三章 融合蛋白GGH 在毕赤酵母中的表达 | 第35-56页 |
| ·材料与方法 | 第36-44页 |
| ·菌种和质粒 | 第36页 |
| ·培养基 | 第36页 |
| ·工具酶 | 第36-37页 |
| ·试剂 | 第37页 |
| ·主要仪器 | 第37页 |
| ·引物 | 第37页 |
| ·突变体GLP-1A2G分子模型的构建、结构优化及与GLP-1 受体胞外区的对接 | 第37-38页 |
| ·重组菌KM71(PPIC9K-GGH)的构建与鉴定 | 第38-43页 |
| ·融合蛋白GGH 的表达 | 第43页 |
| ·发酵液中融合蛋白GGH 的western blot 鉴定[88] | 第43-44页 |
| ·发酵液中融合蛋白GGH 的检测 | 第44页 |
| ·结果与讨论 | 第44-55页 |
| ·突变体GLP-1A2G 分子模型的构建、结构优化及其与GLP-1 受体胞外区的对接 | 第44-49页 |
| ·(GLP-1A2G)2 和HSA 基因的PCR 扩增 | 第49页 |
| ·(GLP-1A2G)2 基因和HSA 基因的拼接 | 第49-50页 |
| ·重组表达质粒pPIC9K-GGH 的构建 | 第50-52页 |
| ·重组表达质粒pPIC9K-GGH 序列的测定 | 第52页 |
| ·重组表达菌株KM71（pPIC9K-GGH）的构建及筛选 | 第52-54页 |
| ·重组毕赤酵母KM71(PPIC9K-GGH)鉴定 | 第54页 |
| ·融合蛋白的western blot 鉴定 | 第54-55页 |
| ·本章结论 | 第55-56页 |
| 第四章 营养及环境条件对毕赤酵母KM71(PPIC9K-GGH)生长和表达的影响 | 第56-70页 |
| ·材料与方法 | 第56-59页 |
| ·菌种 | 第56页 |
| ·培养基 | 第56-57页 |
| ·主要原料与试剂 | 第57页 |
| ·主要仪器设备 | 第57页 |
| ·分析方法 | 第57-58页 |
| ·菌株KM71(PPIC9K-GGH)的生长特性 | 第58页 |
| ·菌株KM71(pPIC9K-GGH)的诱导表达特性 | 第58-59页 |
| ·结果与讨论 | 第59-68页 |
| ·细胞光密度值(OD600)与细胞干重(DCW)的关系 | 第59页 |
| ·毕赤酵母KM71(pPIC9K-GGH)种龄的确定 | 第59-60页 |
| ·营养和环境条件对毕赤酵母KM71(pPIC9K-GGH)生长的影响 | 第60-65页 |
| ·营养和环境条件对毕赤酵母KM71(pPIC9K-GGH)表达的影响 | 第65-68页 |
| ·本章结论 | 第68-70页 |
| 第五章 融合蛋白GGH 的分离纯化及其生物学活性的研究 | 第70-82页 |
| ·材料与方法 | 第70-73页 |
| ·细胞株与动物 | 第70页 |
| ·材料 | 第70-71页 |
| ·主要仪器设备 | 第71页 |
| ·融合蛋白GGH 的分离方法 | 第71-72页 |
| ·纯度检测方法 | 第72页 |
| ·融合蛋白GGH 的生物活性检测 | 第72-73页 |
| ·结果与讨论 | 第73-80页 |
| ·融合蛋白GGH 的超滤浓缩 | 第73-74页 |
| ·融合蛋白GGH 的大孔树脂脱色 | 第74-76页 |
| ·融合蛋白GGH 的离子交换 | 第76-77页 |
| ·融合蛋白GGH 的凝胶层析 | 第77页 |
| ·融合蛋白GGH 的纯度鉴定 | 第77-78页 |
| ·融合蛋白GGH 的纯化过程 | 第78-79页 |
| ·融合蛋白GGH 的体外活性 | 第79页 |
| ·融合蛋白GGH 的体内活性 | 第79-80页 |
| ·本章结论 | 第80-82页 |
| 第六章 融合蛋白GGH 在小鼠体内的初步药代动力学研究 | 第82-91页 |
| ·材料与方法 | 第82-84页 |
| ·材料 | 第82页 |
| ·主要仪器设备 | 第82页 |
| ·实验动物 | 第82-83页 |
| ·~(125)I-GGH 的制备 | 第83页 |
| ·回收及干扰实验 | 第83-84页 |
| ·血浆药物浓度- 时间曲线的测定及其药物在小鼠体内的分布 | 第84页 |
| ·小鼠体内~(125)I-GGH 的排泄 | 第84页 |
| ·药代动力学参数的计算 | 第84页 |
| ·结果与讨论 | 第84-90页 |
| ·~(125)I-GGH 的制备 | 第84-85页 |
| ·~(125)I-GGH 生物活性测定 | 第85页 |
| ·~(125)I-GGH 回收实验 | 第85-86页 |
| ·~(125)I-GGH 血清及组织干扰实验 | 第86-87页 |
| ·血浆药物浓度-时间曲线的测定、药代动力学参数的计算 | 第87-88页 |
| ·融合蛋白在小鼠体内的组织分布 | 第88-89页 |
| ·小鼠体内~(125)I-GGH 的排泄 | 第89-90页 |
| ·本章结论 | 第90-91页 |
| 结论与展望 | 第91-93页 |
| 论文创新点 | 第93-94页 |
| 致谢 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-103页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第103页 |
