| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-12页 |
| 1 前言 | 第12-32页 |
| ·香蕉枯萎病概况 | 第12-13页 |
| ·香蕉枯萎病菌的分子生物学研究进展 | 第13-15页 |
| ·香蕉枯萎病菌的遗传多态性研究进展 | 第13-14页 |
| ·香蕉枯萎病病原菌致病分子机理研究进展 | 第14-15页 |
| ·研究香蕉枯萎病菌致病相关基因的意义 | 第15页 |
| ·香蕉枯萎病菌基因功能研究策略 | 第15-23页 |
| ·香蕉枯萎病病原菌正向遗传学研究中常用的两种转化方法 | 第16-18页 |
| ·PEG介导原生质体转化法 | 第16-17页 |
| ·农杆菌介导T-DNA插入转化法 | 第17-18页 |
| ·香蕉枯萎病病原菌基因功能研究中的已用到的两种反向遗传学技术 | 第18-20页 |
| ·基于基因同源性的克隆法 | 第19页 |
| ·基于蛋白质的克隆法 | 第19-20页 |
| ·香蕉枯萎病菌基因功能研究中需要同时运用反向遗传学技术与正向遗传学相关技术 | 第20-21页 |
| ·农杆菌介导T-DNA插入转化法在真菌转化中的优势 | 第21-22页 |
| ·农杆菌介导T-DNA插入后T-DNA整合方式的研究 | 第22-23页 |
| ·插入突变侧翼序列的克隆方法 | 第23-30页 |
| ·连接成环PCR策略 | 第23-24页 |
| ·外源接头介导PCR | 第24-25页 |
| ·双链接头 | 第24-25页 |
| ·单链接头 | 第25页 |
| ·半随机引物PCR | 第25-30页 |
| ·新Alu-PCR | 第26页 |
| ·TAIL-PCR | 第26-27页 |
| ·DW-ACPTM技术 | 第27-30页 |
| ·PCR方法外经常用到的质粒拯救技术 | 第30页 |
| ·选题意义和目标 | 第30页 |
| ·T-DNA介导的香蕉枯萎镰刀菌4号生理小种遗传转化及致病相关基因克隆的技术路线 | 第30-32页 |
| 2 材料与方法 | 第32-50页 |
| ·材料 | 第32-34页 |
| ·供试香蕉枯萎病病原菌 | 第32页 |
| ·菌株和质粒 | 第32-33页 |
| ·供试香蕉叶片 | 第33页 |
| ·主要生化试剂 | 第33页 |
| ·引物合成 | 第33页 |
| ·培养基 | 第33-34页 |
| ·供试巴西蕉组培苗 | 第34页 |
| ·香蕉枯萎病病原菌分离鉴定及致病性测定方法 | 第34-39页 |
| ·菌株的培养 | 第34页 |
| ·香蕉枯萎病病原菌分离与纯化 | 第34页 |
| ·病原菌经典病理学鉴定方法 | 第34页 |
| ·病原菌致病性测定方法 | 第34-35页 |
| ·病原菌种类分子鉴定方法 | 第35-36页 |
| ·菌丝的培养及处理 | 第35页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第35-36页 |
| ·菌株rDNA-ITS序列扩增 | 第36-39页 |
| ·PCR反应 | 第36页 |
| ·PCR产物回收 | 第36-37页 |
| ·E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第37页 |
| ·目的片段的连接 | 第37-38页 |
| ·大肠杆菌转化 | 第38页 |
| ·蓝白斑筛选鉴定阳性克隆 | 第38页 |
| ·Colony PCR鉴定阳性克隆 | 第38-39页 |
| ·测序与生物信息学分析 | 第39页 |
| ·根癌农杆菌介导的香蕉枯萎病菌4号生理小种转化方法 | 第39-43页 |
| ·碱裂解法提取质粒DNA | 第39-40页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备 | 第40页 |
| ·农杆菌转化 | 第40页 |
| ·农杆菌菌种的保存 | 第40-41页 |
| ·实验所用的野生型香蕉枯萎病菌4号小种的获得 | 第41页 |
| ·香蕉枯萎病菌4号小种的单孢分离 | 第41页 |
| ·插入突变所用的野生型香蕉枯萎病菌4号小种的筛选 | 第41页 |
| ·香蕉枯萎病菌4号生理小种菌种的保存 | 第41-42页 |
| ·香蕉枯萎病菌4号小种的遗传转化 | 第42-43页 |
| ·野生型菌株对潮霉素B的敏感性检测 | 第42页 |
| ·ATMT转化体系中根癌农杆菌的处理 | 第42页 |
| ·香蕉枯萎病4号小种193-6分生孢子的准备 | 第42页 |
| ·4号小种病原菌的转化及筛选 | 第42页 |
| ·转化中影响因子的优化 | 第42-43页 |
| ·香蕉枯萎病菌4号小种转化子的分析 | 第43-45页 |
| ·转化子的纯化保存及遗传稳定性检测 | 第43页 |
| ·转化子致病力的测定 | 第43-44页 |
| ·转化子的PCR验证 | 第44-45页 |
| ·转化子总DNA的快速提取 | 第44页 |
| ·PCR检测 | 第44-45页 |
| ·致病性显著变化转化子生物学特性的测定 | 第45页 |
| ·部分致病性明显变化转化子菌落生长形态的比较 | 第45页 |
| ·部分致病性明显变化转化子菌落生长速度测定 | 第45页 |
| ·致病性显著变化转化子的侧翼序列的扩增 | 第45-50页 |
| ·转化子侧翼序列的扩增中DW-ACP-PCR技术的选择 | 第45-46页 |
| ·目标特异性引物的设计 | 第46页 |
| ·DW-ACP-PCR技术的三轮PCR反应 | 第46-47页 |
| ·转化子侧翼序列的克隆 | 第47-50页 |
| ·PCR产物回收 | 第47-48页 |
| ·E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第48页 |
| ·目的片段的连接 | 第48-49页 |
| ·大肠杆菌转化 | 第49页 |
| ·蓝白斑筛选鉴定阳性克隆 | 第49页 |
| ·Colony PCR鉴定阳性克隆 | 第49-50页 |
| 3 结果与分析 | 第50-62页 |
| ·海南省不同来源香蕉枯萎病病原菌4号小种分离鉴定及致病性测定结果 | 第50-51页 |
| ·海南省不同来源香蕉枯萎病病原菌经典病理学鉴定 | 第50页 |
| ·海南省不同来源香蕉枯萎病病原菌病原菌种类分子鉴定 | 第50页 |
| ·海南省不同来源香蕉枯萎病病原菌致病性测定结果 | 第50页 |
| ·海南省不同地区的香蕉枯萎病病原的确定 | 第50页 |
| ·应用于T-DNA插入突变的4号生理小种模式野生菌株的确定 | 第50-51页 |
| ·香蕉枯萎病菌4号生理小种遗传转化的结果与分析 | 第51-56页 |
| ·4号生理小种193-6对潮霉素B的敏感性测定 | 第51-52页 |
| ·Focr4孢子浓度对转化效率的影响 | 第52页 |
| ·农杆菌菌株AGL-1浓度对转化效率的影响 | 第52-53页 |
| ·液体IM培养基诱导农杆菌时间对转化效率的影响 | 第53页 |
| ·IM固体培养基中诱导剂AS浓度对转化效率的影响 | 第53-54页 |
| ·细菌与真菌共培养时间对转化效率的影响 | 第54-55页 |
| ·细菌与真菌共培养温度对转化效率的影响 | 第55页 |
| ·pH值对转化效率的影响 | 第55-56页 |
| ·香蕉枯萎病菌4号小种转化子的分析 | 第56-59页 |
| ·转化子的PCR鉴定 | 第56-57页 |
| ·转化子的遗传稳定性测定结果 | 第57页 |
| ·转化子致病力的测定 | 第57-59页 |
| ·部分致病性变化转化子生物学特性的测定 | 第59-60页 |
| ·部分致病性明显变化转化子菌落生长形态的比较 | 第59-60页 |
| ·部分致病性明显变化转化子菌落生长速度测定 | 第60页 |
| ·致病性丧失或致病性严重减弱或致病性严重加强转化子的侧翼序列的扩增 | 第60-62页 |
| ·DW-ACP-PCR扩增得到T-DNA插入位点的侧翼序列特异性条带 | 第60-61页 |
| ·DW-ACP-PCR特异性产物的克隆 | 第61-62页 |
| ·T-DNA插入侧翼目标片段的测序与分析结果 | 第62页 |
| 4 讨论 | 第62-67页 |
| ·根癌农杆菌介导的香蕉枯萎病菌4号生理小种转化条件的优化 | 第62-63页 |
| ·关于香蕉枯萎病菌4号生理小种突变体的致病性测定 | 第63-64页 |
| ·关于突变体侧翼序列克隆方法的分析 | 第64-67页 |
| ·突变体侧翼序列克隆方法的选择 | 第64-65页 |
| ·关于DW-ACP-PCR技术 | 第65-67页 |
| ·DW-ACP-PCR技术中TSP引物的设计 | 第65页 |
| ·DW-ACP-PCR技术的优缺点 | 第65-66页 |
| ·DW-ACP技术操作体系的优化 | 第66-67页 |
| ·有待进一步研究的问题 | 第67页 |
| 5 结论 | 第67-68页 |
| ·对海南省不同地区来源的香蕉枯萎病植株上的病原菌进行了鉴定 | 第67页 |
| ·对香蕉枯萎病菌4号生理小种的ATMT转化体系进行了优化 | 第67-68页 |
| ·构建了一个库容量为2520的香蕉枯萎病菌4号小种T-DNA插入突变体库 | 第68页 |
| ·找到了一种高通量的筛选致病性显著变化突变体的致病性测定方法 | 第68页 |
| ·筛选获得了一批致病性显著变化的突变体 | 第68页 |
| ·运用DW-ACP技术能够很好地扩增突变体插入位点的侧翼序列 | 第68页 |
| 参考文献 | 第68-78页 |
| 附录 | 第78-83页 |
| 附录1 缩略词表 | 第78-79页 |
| 附录2 常用培养基、试剂配方 | 第79-81页 |
| 1 常用培养基配方 | 第79页 |
| 2 常用试剂配方 | 第79-81页 |
| 附录3 本实验所涉及的质粒图谱 | 第81页 |
| 附录4 实验主要仪器设备 | 第81-82页 |
| 附录5 相关序列信息 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83页 |
