| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第11-21页 |
| 1.1 肿瘤坏死因子的生理功能及应用 | 第11页 |
| 1.2 肿瘤坏死因子的两种特异性受体——Ⅰ型和Ⅱ型 | 第11-12页 |
| 1.3 可溶性肿瘤坏死因子Ⅰ型受体简介 | 第12-13页 |
| 1.3.1 可溶性肿瘤坏死因子Ⅰ型受体结构及生理功能 | 第12页 |
| 1.3.2 可溶性肿瘤坏死因子Ⅰ型受体在医学领域的应用 | 第12页 |
| 1.3.3 可溶性肿瘤坏死因子Ⅰ型受体重组表达的研究进展 | 第12-13页 |
| 1.4 多二硫键蛋白 | 第13-14页 |
| 1.4.1 二硫键的形成机制 | 第13页 |
| 1.4.2 二硫键与蛋白质折叠 | 第13-14页 |
| 1.5 大肠杆菌表达系统 | 第14-16页 |
| 1.5.1 大肠杆菌表达系统的特点 | 第14页 |
| 1.5.2 大肠杆菌表达系统的分泌途径 | 第14-16页 |
| 1.6 重组蛋白在大肠杆菌中异源表达的策略 | 第16-19页 |
| 1.6.1 融合标签技术 | 第16页 |
| 1.6.2 分子伴侣 | 第16-17页 |
| 1.6.3 信号肽与蛋白分泌 | 第17-18页 |
| 1.6.4 辅助蛋白引导重组蛋白分泌到胞外 | 第18页 |
| 1.6.5 细胞膜通透性 | 第18-19页 |
| 1.7 本文的研究意义与内容 | 第19-21页 |
| 1.7.1 研究意义 | 第19页 |
| 1.7.2 研究内容 | 第19-21页 |
| 第二章 材料与方法 | 第21-37页 |
| 2.1 实验材料 | 第21-28页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第21-25页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第25-26页 |
| 2.1.3 试剂配制 | 第26-27页 |
| 2.1.4 主要培养基 | 第27页 |
| 2.1.5 主要仪器 | 第27-28页 |
| 2.2 实验方法 | 第28-37页 |
| 2.2.1 琼脂糖凝胶电泳 | 第28-29页 |
| 2.2.2 常规PCR反应 | 第29页 |
| 2.2.3 PCR产物纯化回收 | 第29-30页 |
| 2.2.4 PCR产物胶回收 | 第30页 |
| 2.2.5 酵母基因组提取方法 | 第30-31页 |
| 2.2.6 Gibson组装 | 第31页 |
| 2.2.7 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化 | 第31-32页 |
| 2.2.8 质粒提取 | 第32-33页 |
| 2.2.9 菌落PCR验证 | 第33页 |
| 2.2.10 电击转化法大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备及转化 | 第33-34页 |
| 2.2.11 重组蛋白诱导表达 | 第34-35页 |
| 2.2.12 SDS-PAGE检测 | 第35页 |
| 2.2.13 蛋白纯化 | 第35页 |
| 2.2.14 Western Blot分析 | 第35-36页 |
| 2.2.15 TEV蛋白酶酶切 | 第36-37页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第37-58页 |
| 3.1 sTNFR1在大肠杆菌中重组表达 | 第37-41页 |
| 3.1.1 sTNFR1蛋白信息 | 第37-38页 |
| 3.1.2 基因克隆与质粒构建 | 第38-39页 |
| 3.1.3 大肠杆菌中诱导表达 | 第39-41页 |
| 3.2 提高sTNFR1在大肠杆菌中可溶性表达 | 第41-52页 |
| 3.2.1 融合标签辅助蛋白可溶性表达 | 第41-43页 |
| 3.2.1.1 基因克隆与质粒构建 | 第41-42页 |
| 3.2.1.2 融合蛋白在大肠杆菌中诱导表达 | 第42-43页 |
| 3.2.2 过表达酵母二硫键巯基氧化酶 | 第43-45页 |
| 3.2.2.1 Erv1基因密码子优化及质粒构建 | 第43页 |
| 3.2.2.2 在大肠杆菌中的表达 | 第43-45页 |
| 3.2.3 过表达胞内分子伴侣 | 第45-48页 |
| 3.2.3.1 分子伴侣质粒信息 | 第45-46页 |
| 3.2.3.2 大肠杆菌中诱导表达 | 第46-48页 |
| 3.2.4 摇瓶发酵培养条件优化 | 第48-50页 |
| 3.2.4.1 优化摇瓶发酵诱导温度的单因素实验 | 第48-49页 |
| 3.2.4.2 优化摇瓶发酵培养IPTG浓度的单因素实验 | 第49-50页 |
| 3.2.5 Ni-NTA亲和层析纯化可溶性蛋白 | 第50-51页 |
| 3.2.6 TEV蛋白酶酶去除融合标签 | 第51页 |
| 3.2.7 Western Blot分析鉴定 | 第51-52页 |
| 3.3 sTNFR1在大肠杆菌中胞外分泌 | 第52-58页 |
| 3.3.1 信号肽的筛选 | 第52-54页 |
| 3.3.1.1 基因克隆与质粒构建 | 第52-53页 |
| 3.3.1.2 大肠杆菌中诱导表达 | 第53-54页 |
| 3.3.2 利用辅助蛋白osmY或YebF引导sTNFR1胞外分泌 | 第54-56页 |
| 3.3.2.1 基因克隆和质粒构建 | 第54页 |
| 3.3.2.2 大肠杆菌中诱导表达 | 第54-56页 |
| 3.3.3 增加细胞膜的通透性促进sTNFR1分泌 | 第56-58页 |
| 3.3.3.1 基因克隆和质粒构建 | 第56-58页 |
| 第四章 结论 | 第58-59页 |
| 展望 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 研究成果 | 第66页 |
