| 摘要 | 第4-5页 |
| abstract | 第5页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-20页 |
| 1.1 磷脂 | 第11-14页 |
| 1.1.1 磷脂的来源组成及结构 | 第11页 |
| 1.1.2 磷脂的性质 | 第11-13页 |
| 1.1.3 磷脂功能 | 第13页 |
| 1.1.4 磷脂改性 | 第13-14页 |
| 1.1.5 磷脂的应用 | 第14页 |
| 1.2 磷脂酶D | 第14-19页 |
| 1.2.1 磷脂酶 | 第14-15页 |
| 1.2.2 磷脂酶D的概况 | 第15-18页 |
| 1.2.2.1 磷脂酶D的来源 | 第15-16页 |
| 1.2.2.2 磷脂酶D的生理功能 | 第16页 |
| 1.2.2.3 磷脂酶D的催化反应机理 | 第16-17页 |
| 1.2.2.4 磷脂酶D的反应影响因素 | 第17-18页 |
| 1.2.3 磷脂酶D的应用 | 第18-19页 |
| 1.3 本论文研究内容 | 第19-20页 |
| 第二章 磷脂酶D产生菌的筛选与鉴定 | 第20-43页 |
| 2.1 材料与试剂 | 第20-21页 |
| 2.2 仪器设备 | 第21页 |
| 2.3 培养基 | 第21-23页 |
| 2.3.1 生长培养基 | 第21-22页 |
| 2.3.2 分类鉴定培养基 | 第22-23页 |
| 2.3.3 标准菌株 | 第23页 |
| 2.4 实验方法 | 第23-32页 |
| 2.4.1 磷脂酶D产生菌的筛选 | 第23-24页 |
| 2.4.1.1 磷脂酶D产生菌的初筛 | 第23页 |
| 2.4.1.2 磷脂酶D产生菌的复筛 | 第23-24页 |
| 2.4.2 培养特征分析 | 第24页 |
| 2.4.3 形态特征分析 | 第24-25页 |
| 2.4.3.1 革兰氏染色 | 第24页 |
| 2.4.3.2 芽孢染色 | 第24页 |
| 2.4.3.3 扫描电镜实验(SEM) | 第24-25页 |
| 2.4.4 16SrRNA的序列分析 | 第25页 |
| 2.4.5 生理生化特征鉴定 | 第25-29页 |
| 2.4.5.1 生长曲线 | 第25-26页 |
| 2.4.5.2 生长温度范围 | 第26页 |
| 2.4.5.3 生长pH范围 | 第26页 |
| 2.4.5.4 耐盐度 | 第26页 |
| 2.4.5.5 运动性实验 | 第26页 |
| 2.4.5.6 需氧性试验 | 第26-27页 |
| 2.4.5.7 石蕊牛奶实验 | 第27页 |
| 2.4.5.8 酪素水解实验 | 第27页 |
| 2.4.5.9 马尿酸盐水解实验 | 第27页 |
| 2.4.5.10 卵磷脂酶实验 | 第27页 |
| 2.4.5.11 过氧化氢酶(接触酶)实验 | 第27-28页 |
| 2.4.5.12 明胶液化 | 第28页 |
| 2.4.5.13 淀粉水解反应 | 第28页 |
| 2.4.5.14 硝酸盐还原实验 | 第28页 |
| 2.4.5.15 抗生素敏感实验 | 第28-29页 |
| 2.4.6 化学特征分析-磷酸类脂分析 | 第29-30页 |
| 2.4.6.1 菌体收集 | 第29页 |
| 2.4.6.2 磷酸类脂的提取 | 第29页 |
| 2.4.6.3 磷酸类脂显色剂配置 | 第29-30页 |
| 2.4.6.4 点样与层析 | 第30页 |
| 2.4.6.5 薄板显色 | 第30页 |
| 2.4.7 分子特征分析-DNA(G+C)mol%含量分析 | 第30-32页 |
| 2.4.7.1 DNA提取 | 第30-31页 |
| 2.4.7.2 DNA的纯化 | 第31页 |
| 2.4.7.3 DNA的纯度检测 | 第31页 |
| 2.4.7.4 DNA的酶解 | 第31页 |
| 2.4.7.5 G+C含量的测定 | 第31-32页 |
| 2.5 结果与讨论 | 第32-41页 |
| 2.5.1 磷脂酶D产生菌的筛选及培养特征分析 | 第32页 |
| 2.5.2 形态特征分析 | 第32-34页 |
| 2.5.2.1 革兰氏染色 | 第32-33页 |
| 2.5.2.2 芽孢染色 | 第33页 |
| 2.5.2.3 扫描电镜(SEM) | 第33-34页 |
| 2.5.3 系统发育树的构建 | 第34-36页 |
| 2.5.4 生理生化特征鉴定 | 第36-41页 |
| 2.5.4.1 生长曲线 | 第36-37页 |
| 2.5.4.2 生长温度范围 | 第37-38页 |
| 2.5.4.3 生长PH范围 | 第38页 |
| 2.5.4.4 耐盐度 | 第38-39页 |
| 2.5.4.5 生理生化特征实验结果 | 第39页 |
| 2.5.4.6 抗生素敏感性 | 第39-40页 |
| 2.5.4.7 化学特征分析-磷酸类脂分析结果 | 第40-41页 |
| 2.5.4.8 基因特征——DNA(G+C)mol%含量分析 | 第41页 |
| 2.6 本章小结 | 第41-43页 |
| 第三章 磷脂酶D活性检测方法的建立 | 第43-51页 |
| 3.1 材料与试剂 | 第43页 |
| 3.2 实验方法 | 第43-45页 |
| 3.2.1 试剂配制 | 第43-44页 |
| 3.2.2 粗酶液的制备 | 第44页 |
| 3.2.3 最佳吸收波长的选择 | 第44页 |
| 3.2.4 标准曲线的绘制 | 第44页 |
| 3.2.5 酶活的测定 | 第44页 |
| 3.2.6 发酵液用量的选择 | 第44-45页 |
| 3.2.7 酶反应时间的选择 | 第45页 |
| 3.2.8 雷氏盐用量的选择 | 第45页 |
| 3.2.9 与雷氏盐反应时间的选择 | 第45页 |
| 3.2.10 蛋白沉淀量对胆碱雷氏盐生成的影响 | 第45页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第45-50页 |
| 3.3.1 测定波长的选择 | 第45-46页 |
| 3.3.2 标准曲线绘制和检出限 | 第46-47页 |
| 3.3.3 发酵液用量的选择 | 第47页 |
| 3.3.4 酶反应时间的选择 | 第47-48页 |
| 3.3.5 雷氏盐用量的选择 | 第48-49页 |
| 3.3.6 与雷氏盐反应时间的选择 | 第49页 |
| 3.3.7 蛋白沉淀量对胆碱雷氏盐生成的影响 | 第49-50页 |
| 3.4 本章小结 | 第50-51页 |
| 第四章 磷脂酶D基因表达载体的构建 | 第51-62页 |
| 4.1 实验材料 | 第51-53页 |
| 4.1.1 实验试剂 | 第51页 |
| 4.1.2 实验菌株及质粒 | 第51-52页 |
| 4.1.3 PCR引物 | 第52页 |
| 4.1.4 培养基 | 第52页 |
| 4.1.5 实验试剂 | 第52-53页 |
| 4.2 实验方法 | 第53-59页 |
| 4.2.1 目的基因扩增及验证 | 第53-55页 |
| 4.2.1.1 目的基因扩增 | 第53-54页 |
| 4.2.1.2 琼脂糖凝胶电泳及胶回收 | 第54-55页 |
| 4.2.2 克隆质粒的构建 | 第55-56页 |
| 4.2.2.1 感受态细胞的制备 | 第55页 |
| 4.2.2.2 质粒DNA转化方法 | 第55-56页 |
| 4.2.3 PCR克隆检测及酶切验证 | 第56-57页 |
| 4.2.3.1 PCR克隆检测 | 第56页 |
| 4.2.3.2 质粒的提取(碱裂解法) | 第56-57页 |
| 4.2.3.3 酶切体系 | 第57页 |
| 4.2.4 表达载体构建 | 第57-59页 |
| 4.2.4.1 大肠杆菌表达宿主rosetta超级感受态的制备 | 第58页 |
| 4.2.4.2 双酶切体系 | 第58页 |
| 4.2.4.3 连接体系 | 第58-59页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第59-61页 |
| 4.3.1 磷脂酶D基因的筛选与克隆 | 第59-60页 |
| 4.3.2 磷脂酶D基因的表达载体的构建 | 第60-61页 |
| 4.4 本章小结 | 第61-62页 |
| 结论 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-66页 |
| 致谢 | 第66页 |
