| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 第一章 绪论 | 第11-32页 |
| 1.1 L-苯甘氨酸概述 | 第11页 |
| 1.2 L-苯甘氨酸的合成方法 | 第11-15页 |
| 1.2.1 L-苯甘氨酸的化学合成 | 第11-12页 |
| 1.2.2 L-苯甘氨酸的化学酶法合成 | 第12-13页 |
| 1.2.3 L-苯甘氨酸的生物法合成 | 第13-15页 |
| 1.3 亮氨基酸脱氢酶 | 第15-17页 |
| 1.3.1 亮氨酸脱氢酶基因挖掘 | 第15-16页 |
| 1.3.2 亮氨酸脱氢酶分子改造 | 第16-17页 |
| 1.4 辅酶再生 | 第17页 |
| 1.5 多酶组装 | 第17-26页 |
| 1.5.1 基于材料的多酶共固定化 | 第19-24页 |
| 1.5.2 蛋白融合共位组装 | 第24-25页 |
| 1.5.3 蛋白支架介导的多酶组装 | 第25-26页 |
| 1.6 全细胞催化及其固定化 | 第26-28页 |
| 1.6.1 全细胞催化概述 | 第26页 |
| 1.6.2 细胞固定化 | 第26-28页 |
| 1.7 磁性纳米材料 | 第28-30页 |
| 1.7.1 磁性纳米材料的特性 | 第29页 |
| 1.7.2 磁性纳米材料的制备及修饰 | 第29-30页 |
| 1.8 本论文立体依据及研究内容 | 第30-32页 |
| 1.8.1 立体依据与研究意义 | 第30-31页 |
| 1.8.2 研究内容 | 第31-32页 |
| 第二章 酶法催化合成L-苯甘氨酸体系的构建及转化条件优化 | 第32-45页 |
| 2.1 引言 | 第32-33页 |
| 2.2 材料与方法 | 第33-38页 |
| 2.2.1 菌株、质粒及引物 | 第33页 |
| 2.2.2 主要试剂与仪器 | 第33-35页 |
| 2.2.3 重组质粒及重组菌的构建 | 第35页 |
| 2.2.4 培养基及培养条件 | 第35-36页 |
| 2.2.5 酶活测定 | 第36-37页 |
| 2.2.6 转化条件优化 | 第37页 |
| 2.2.7 产物与底物的检测分析 | 第37-38页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第38-43页 |
| 2.3.1 BcLeuDH、CbFDH和BsGDH基因的克隆和表达 | 第38-39页 |
| 2.3.2 L-苯甘氨酸酶催化合成体系的构建 | 第39-40页 |
| 2.3.3 温度及pH对L-苯甘氨酸合成的影响 | 第40-41页 |
| 2.3.4 酶比例、辅底物与底物比例对L-苯甘氨酸合成的影响 | 第41页 |
| 2.3.5 底物浓度、酶的添加量及NAD+浓度对L-苯甘氨酸合成的影响 | 第41-43页 |
| 2.4 本章小结 | 第43-45页 |
| 第三章 酶的活性共聚集体的制备及磁性固定化研究 | 第45-63页 |
| 3.1 引言 | 第45-46页 |
| 3.2 材料与方法 | 第46-52页 |
| 3.2.1 菌株、质粒及引物 | 第46-48页 |
| 3.2.2 主要试剂与仪器 | 第48-50页 |
| 3.2.3 重组质粒与重组菌的构建 | 第50-51页 |
| 3.2.4 培养基与培养条件 | 第51页 |
| 3.2.5 酶活的测定 | 第51页 |
| 3.2.6 Cip蛋白对酶的稳定性的影响 | 第51-52页 |
| 3.2.7 活性酶共聚集体的磁性固定化 | 第52页 |
| 3.2.8 活性酶共聚集体转化合成L-苯甘氨酸 | 第52页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第52-62页 |
| 3.3.1 CipA及CipB在大肠杆菌中的表达 | 第52-53页 |
| 3.3.2 CipA及CipB与BcLeuDH及CbFDH的融合表达 | 第53-57页 |
| 3.3.3 融合酶的热稳定性和pH稳定性分析 | 第57页 |
| 3.3.4 BcLeuDH和CbFDH的胞内共聚集 | 第57-59页 |
| 3.3.5 磁性纳米Fe_3O_4对AIB-M的固定化 | 第59-60页 |
| 3.3.6 磁性固定化AIB-M用于L-苯甘氨酸的合成 | 第60-62页 |
| 3.4 本章小结 | 第62-63页 |
| 第四章 全细胞转化体系的构建及优化 | 第63-84页 |
| 4.1 引言 | 第63页 |
| 4.2 材料与方法 | 第63-68页 |
| 4.2.1 菌株、质粒及引物 | 第63-66页 |
| 4.2.2 主要试剂与仪器 | 第66页 |
| 4.2.3 重组质粒与重组菌的构建 | 第66-67页 |
| 4.2.4 培养基及培养条件 | 第67页 |
| 4.2.5 蛋白表达及酶活测定 | 第67-68页 |
| 4.2.6 胞内NAD(H)水平的检测 | 第68页 |
| 4.2.7 产物与底物的检测分析 | 第68页 |
| 4.2.8 全细胞催化活性测定 | 第68页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第68-83页 |
| 4.3.1 共表达重组菌的构建及全细胞转化合成L-苯甘氨酸 | 第68-70页 |
| 4.3.2 BcLeuDH和CbFDH表达量的调节和优化 | 第70-73页 |
| 4.3.3 重组菌转化性能的对比 | 第73-74页 |
| 4.3.4 细胞量及底物浓度对全细胞转化的影响 | 第74-75页 |
| 4.3.5 NAD~+的添加对全细胞转化的影响 | 第75-77页 |
| 4.3.6 NAD~+合成途径关键酶基因的克隆表达 | 第77-78页 |
| 4.3.7 NAPRTase和NAD~+Syn的表达对菌体生长及胞内辅酶水平的影响 | 第78-79页 |
| 4.3.8 烟酸的浓度对菌体生长及胞内辅酶水平的影响 | 第79-80页 |
| 4.3.9 NAPRTase和NAD~+Syn的表达及烟酸的添加对全细胞转化的影响 | 第80-81页 |
| 4.3.10 1L体系全细胞转化合成L-苯甘氨酸 | 第81-83页 |
| 4.4 本章小结 | 第83-84页 |
| 第五章 大肠杆菌的磁性固定化及应用研究 | 第84-99页 |
| 5.1 引言 | 第84-85页 |
| 5.2 材料与方法 | 第85-88页 |
| 5.2.1 菌株 | 第85页 |
| 5.2.2 主要试剂与仪器 | 第85页 |
| 5.2.3 培养基及培养条件 | 第85页 |
| 5.2.4 磁性纳米Fe_3O_4的合成 | 第85-86页 |
| 5.2.5 磁性复合纳米材料Fe_3O_4@PEI的合成 | 第86页 |
| 5.2.6 磁性纳米材料的表征 | 第86页 |
| 5.2.7 静息细胞悬液的制备 | 第86-87页 |
| 5.2.8 大肠杆菌细胞的磁性固定化 | 第87页 |
| 5.2.9 磁性细胞复合物的表征 | 第87页 |
| 5.2.10 磁性固定化细胞活性评价 | 第87页 |
| 5.2.11 Fe_3O_4@PEI固定化细胞的条件优化 | 第87-88页 |
| 5.2.12 磁性固定化细胞稳定性及重复使用性评价 | 第88页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第88-98页 |
| 5.3.1 Fe_3O_4@PEI的合成及表征 | 第88-91页 |
| 5.3.2 磁性固定化细胞的制备 | 第91-94页 |
| 5.3.3 固定化细胞的形貌观察 | 第94-95页 |
| 5.3.4 固定化细胞与游离细胞稳定性比较 | 第95-96页 |
| 5.3.5 固定化细胞的重复利用情况 | 第96-97页 |
| 5.3.6 1L体系中固定化细胞转化合成L-苯甘氨酸 | 第97-98页 |
| 5.4 本章小结 | 第98-99页 |
| 主要结论与展望 | 第99-101页 |
| 论文创新点 | 第101-102页 |
| 致谢 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-120页 |
| 附录 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第120页 |
