| 中文摘要 | 第11-13页 |
| ABSTRACT | 第13-15页 |
| LIST OF ABBREVIATIONS | 第16-19页 |
| 1 INTRODUCTION | 第19-40页 |
| 1.1 Biology of bovine herpesvirus-1 | 第20-21页 |
| 1.2 Virus structure | 第21-22页 |
| 1.3 Virus genome and proteins | 第22-24页 |
| 1.4 Physiochemical properties of the virus | 第24页 |
| 1.5 Host range | 第24-25页 |
| 1.6 Bo HV-1 replication cycle | 第25-28页 |
| 1.6.1 Virus transmission | 第25页 |
| 1.6.2 Virus entry | 第25-26页 |
| 1.6.3 Transcription of Bo HV-1 genome | 第26-28页 |
| 1.7 Virion assembly and egress pathway | 第28页 |
| 1.8 Primary envelopment: virus budding at the inner nuclear membrane | 第28-29页 |
| 1.9 De-envelopment | 第29-30页 |
| 1.10 Re-envelopment/secondary envelopment | 第30-31页 |
| 1.11 Transport and release of virus | 第31-32页 |
| 1.12 Dissemination and spread | 第32-33页 |
| 1.13 The Bo HV-1 latency | 第33-35页 |
| 1.13.1 Establishment of latency | 第33-34页 |
| 1.13.2 Reactivation from latency | 第34-35页 |
| 1.14 Immunology of Bo HV-1 infection | 第35页 |
| 1.15 Functional roles of the tegument proteins in viral assembly and egress | 第35-37页 |
| 1.16 Bovine herpesvirus 1 UL21 protein (p UL21) | 第37-39页 |
| 1.17 Objective of this study | 第39-40页 |
| 2. MATERIALS AND METHODS | 第40-84页 |
| 2.1 Ethical statement regarding animal experiments | 第40页 |
| 2.2 Cells and viruses | 第40页 |
| 2.3 Plasmid vectors and Escherichia coli (E. coli) | 第40页 |
| 2.4 Enzymes and antibodies | 第40-41页 |
| 2.5 Cell culture reagents | 第41页 |
| 2.5.1 Glassware preparation and sterilization | 第41页 |
| 2.5.2 Preparation of cleaning solution | 第41页 |
| 2.5.3 Cell growth and maintenance medium | 第41页 |
| 2.5.4 2X DMEM | 第41页 |
| 2.5.5 Carboxymethyl cellulose (1.6-2%) | 第41页 |
| 2.6 Virus genome extraction and transfection reagents | 第41-43页 |
| 2.6.1 Citrate-buffered saline (p H 3.0) | 第41-42页 |
| 2.6.2 1X phosphate-buffered saline (PBS) p H 7.4 | 第42页 |
| 2.6.3 Cell lysis buffer (p H 8.0) | 第42页 |
| 2.6.4 EDTA 0.5M (p H 8.0) | 第42页 |
| 2.6.5 1M Tris-HCl | 第42页 |
| 2.6.6 15% glycerol DMEM | 第42-43页 |
| 2.6.7 3M Sodium acetate solutions (Na Ac) | 第43页 |
| 2.6.8 2X HBS buffer | 第43页 |
| 2.6.9 2M Calcium chloride solution (Ca Cl2) | 第43页 |
| 2.6.10 Crystal violet preparation for plaque assay | 第43页 |
| 2.6.11 10% formaldehyde solution for fixation of plaque cells | 第43页 |
| 2.6.12 2% L-arabinose solution | 第43页 |
| 2.7 Escherichia coli growth and related reagents | 第43-45页 |
| 2.7.1 Luria-bertani (LB) liquid medium | 第43-44页 |
| 2.7.2 LB agar plates | 第44页 |
| 2.7.3 60% glycerol solution (storage of bacterial culture) | 第44页 |
| 2.7.4 0.8M IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) | 第44页 |
| 2.7.5 PMSF (100m M) | 第44页 |
| 2.7.6 Elution buffer | 第44页 |
| 2.7.7 Coating buffer for ELISA | 第44-45页 |
| 2.8 Antibiotic stocks | 第45页 |
| 2.8.1 Ampicillin (50 μg/ml) | 第45页 |
| 2.8.2 Kanamycin (30 μg/ml) | 第45页 |
| 2.8.3 Chloramphenicol (34 μg/ml) | 第45页 |
| 2.9 Plasmid extraction solutions (alkaline lysis method) | 第45-46页 |
| 2.10 SDS PAGE reagents | 第46-47页 |
| 2.10.1 1.5M Tris buffer p H 8.8 (for separating gels) | 第46页 |
| 2.10.2 1.5M Tris buffer p H 6.8 (for stacking gels) | 第46页 |
| 2.10.3 200m M DTT (dithiothreitol) | 第46页 |
| 2.10.4 SDS loading dye (2X) | 第46页 |
| 2.10.5 Acrylamide (30%) | 第46页 |
| 2.10.6 20% sodium dodecyl sulfate buffer (SDS) (w/v) | 第46-47页 |
| 2.10.7 10% Ammonium persulphate solution (APS) (w/v) | 第47页 |
| 2.10.8 5X Tris-glycine running buffer | 第47页 |
| 2.10.9 Fixing solution | 第47页 |
| 2.10.10 Coomassie blue staining solution | 第47页 |
| 2.10.11 De-staining solution | 第47页 |
| 2.11 Western blotting buffers | 第47-48页 |
| 2.11.1 1X Transfer membrane buffer (TMB) | 第47-48页 |
| 2.11.2 1X Tris-buffered saline tween-20 (TBST) | 第48页 |
| 2.11.3 10X Tris-EDTA buffer (TE) (p H 8.0) | 第48页 |
| 2.12 50X TAE buffer for agarose gel electrophoresis | 第48页 |
| 2.13 MDBK cell maintenance | 第48-49页 |
| 2.13.1 MDBK cell harvesting | 第48页 |
| 2.13.2 Cryopreservation of MDBK cells | 第48-49页 |
| 2.13.3 Recovery of frozen MDBK cells | 第49页 |
| 2.14 BAC construction using En passant mutagenesis | 第49页 |
| 2.15 Construction of UL21 deletion mutant | 第49页 |
| 2.16 PCR for kanamycin gene amplification | 第49-52页 |
| 2.16.1 Agarose gel electrophoresis | 第51页 |
| 2.16.2 Purification of PCR product from agarose gel | 第51-52页 |
| 2.17 Preparation of electrocompetent GS1783 cells | 第52-54页 |
| 2.17.1 Determination of DNA concentration using Nano Drop spectrophotometer | 第53-54页 |
| 2.18 Electroporation and first red recombination | 第54-55页 |
| 2.18.1 Screening of positive BAC clones | 第54页 |
| 2.18.2 BAC DNA extraction | 第54-55页 |
| 2.19 Second red recombination | 第55-57页 |
| 2.19.1 Confirmation of kanamycin cassette deletion | 第56-57页 |
| 2.20 Reversion of ΔUL21 recombinant virus | 第57-58页 |
| 2.21 Construction of hemagglutinin (HA)-tagged recombinant viruses | 第58-59页 |
| 2.22 Generation of recombinant viruses by calcium phosphate co-transfection | 第59-61页 |
| 2.22.1 Propagation of transfected MDBK Cells | 第60页 |
| 2.22.2 Plaque purification of virus | 第60-61页 |
| 2.23 Confirmation of the recombinant viruses | 第61-64页 |
| 2.23.1 Restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) | 第61-62页 |
| 2.23.2 RNA extraction using TRIzol reagent | 第62页 |
| 2.23.3 Elimination of genomic DNA | 第62-63页 |
| 2.23.4 Reverse-transcription reaction | 第63页 |
| 2.23.5 RT-PCR | 第63-64页 |
| 2.24 SDS-PAGE and Western blotting for expression of HA tag | 第64-68页 |
| 2.24.1 Preparation of cell lysate using lysis buffer | 第64-65页 |
| 2.24.2 Preparation of samples for gel loading | 第65页 |
| 2.24.3 SDS-PAGE | 第65-67页 |
| 2.24.4 Coomassie brilliant blue staining (CBB) | 第67页 |
| 2.24.5 Western blot analysis | 第67-68页 |
| 2.25 Growth curve analysis | 第68-70页 |
| 2.25.1 Plaque assay | 第68-69页 |
| 2.25.2 Viral titers calculation (PFU/ml) | 第69-70页 |
| 2.25.3 Plaque size determination | 第70页 |
| 2.26 Characterization of UL21 protein | 第70页 |
| 2.27 Silver staining | 第70-71页 |
| 2.28 Mass spectrometry | 第71-72页 |
| 2.29 Immunofluorescence confocal microscopy | 第72-73页 |
| 2.30 Transmission electron microscopy (TEM) | 第73-74页 |
| 2.31 Protein expression and production of polyclonal antisera | 第74-81页 |
| 2.31.1 Plasmid extraction using TIANpure midi plasmid kit | 第74-75页 |
| 2.31.2 Enzymatic digestion | 第75-76页 |
| 2.31.3 Ligation | 第76页 |
| 2.31.4 Transformation into DH5 alpha (α) cells | 第76-77页 |
| 2.31.5 Transformation into BL21 cells | 第77页 |
| 2.31.6 Protein expressions using IPTG induction | 第77-78页 |
| 2.31.7 GST-tagged protein purification | 第78-79页 |
| 2.31.8 Rabbit immunization and antisera development | 第79页 |
| 2.31.9 Serology of antisera using ELISA | 第79-81页 |
| 2.32 Identification of UL21-interacting proteins | 第81-82页 |
| 2.32.1 Co-immunoprecipitation assay for UL21-HA from infected MDBK cells | 第81页 |
| 2.32.2 Immunofluorescence assay | 第81-82页 |
| 2.33 Statistical analysis | 第82-84页 |
| 3. RESULTS | 第84-106页 |
| 3.1 Construction of mutants BAC and recombinant viruses | 第84-92页 |
| 3.1.1 Construction of UL21 mutant viruses | 第86-87页 |
| 3.1.2 Reversion of Bo HV-1-ΔUL21 | 第87页 |
| 3.1.3 Hemagglutinin (HA)-linked mutant viruses construction | 第87-89页 |
| 3.1.4 Observation of GFP expression and purification of mutant viruses | 第89-90页 |
| 3.1.5 Initial characterization of Bo HV-1 mutant viruses | 第90-92页 |
| 3.2 Growth analysis of UL21 mutant viruses | 第92-93页 |
| 3.2.1 Single step growth kinetics | 第92页 |
| 3.2.2 Plaque morphology | 第92-93页 |
| 3.3 Localization of Bo HV-1 UL21 | 第93-95页 |
| 3.4 Effect of the UL21 deletion on capsid egress | 第95-97页 |
| 3.4.1 Using indirect immunofluorescence assay | 第95页 |
| 3.4.2 Using TEM analysis | 第95-97页 |
| 3.5 Effect of the UL21 deletion on secondary envelopment | 第97-99页 |
| 3.6 Identification of the Bo HV-1 UL21-interacting protein UL16 | 第99-106页 |
| 3.6.1 Construction of protein expression vectors | 第101-102页 |
| 3.6.2 GST protein purifications | 第102-103页 |
| 3.6.3 Antibody titer of UL21/UL16 rabbit antiserum | 第103-104页 |
| 3.6.4 Co-immunoprecipitation of UL16 and UL21 from infected cells | 第104页 |
| 3.6.5 Immunofluorescence microscopy observations of complexes of UL21 with UL16 | 第104-106页 |
| 4. DISCUSSION | 第106-109页 |
| 4.1 Bo HV-1 UL21 is required for efficient virus growth | 第106-107页 |
| 4.2 Bo HV-1 UL21 localized to cytoplasm as well as to the nucleus | 第107页 |
| 4.3 Bo HV-1 UL21 is required for secondary envelopment of capsids | 第107-108页 |
| 4.4 Bo HV-1 UL21 interacts with UL16 | 第108-109页 |
| 5. CONCLUSION | 第109-110页 |
| REFERENCES | 第110-122页 |
| PAPERS PUBLISHED | 第122-123页 |
| ACKNOWLEDGEMENT | 第123-125页 |
