| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-8页 |
| 英文缩写词表 | 第15-16页 |
| 第1章 绪论 | 第16-24页 |
| 1.1 镰刀菌和镰刀菌病 | 第16-17页 |
| 1.2 镰刀菌耐药现状及相关研究 | 第17-18页 |
| 1.2.1 镰刀菌耐药现状 | 第17页 |
| 1.2.2 镰刀菌耐药机制研究进展 | 第17-18页 |
| 1.3 麦角固醇生物合成的调控 | 第18-20页 |
| 1.4 根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化研究进展 | 第20-23页 |
| 1.4.1 农杆菌介导的丝状真菌遗传转化机理 | 第20-21页 |
| 1.4.2 农杆菌介导的丝状真菌遗传转化的优势 | 第21-22页 |
| 1.4.3 根癌农杆菌介导的转化在真菌功能基因中的应用 | 第22-23页 |
| 1.5 本研究的目的和意义 | 第23-24页 |
| 第2章 根癌农杆菌介导的尖孢镰刀菌遗传转化体系建立 | 第24-40页 |
| 2.1 材料与方法 | 第24-27页 |
| 2.1.1 实验菌株和质粒 | 第24页 |
| 2.1.2 引物 | 第24页 |
| 2.1.3 试剂耗材 | 第24-26页 |
| 2.1.4 仪器设备 | 第26-27页 |
| 2.2 方法 | 第27-34页 |
| 2.2.1 尖孢镰刀菌对遗传霉素的敏感性 | 第27页 |
| 2.2.2 用于尖孢镰刀菌遗传转化的载体构建 | 第27-30页 |
| 2.2.2.1 质粒提取 | 第27页 |
| 2.2.2.2 目的基因片段的扩增 | 第27-28页 |
| 2.2.2.3 琼脂糖凝胶回收DNA | 第28页 |
| 2.2.2.4 目的基因片段和质粒双酶切 | 第28-29页 |
| 2.2.2.5 质粒与目的基因片段进行连接 | 第29页 |
| 2.2.2.6 连接产物的转化 | 第29页 |
| 2.2.2.7 克隆质粒的验证 | 第29-30页 |
| 2.2.2.8 根癌农杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第30页 |
| 2.2.3 根癌农杆菌介导的尖孢镰刀菌遗传转化的优化 | 第30-31页 |
| 2.2.3.1 尖孢镰刀菌分生孢子的制备 | 第30页 |
| 2.2.3.2 根癌农杆菌细胞的制备 | 第30-31页 |
| 2.2.3.3 根癌农杆菌与尖孢镰刀菌共培养 | 第31页 |
| 2.2.3.4 转化子的筛选 | 第31页 |
| 2.2.4 转化子遗传稳定性分析 | 第31-34页 |
| 2.2.4.1 尖孢镰刀菌转化子遗传霉素抗性遗传稳定性 | 第31-32页 |
| 2.2.4.2 尖孢镰刀菌基因组DNA的提取 | 第32页 |
| 2.2.4.3 T-DNA插入遗传稳定性分析 | 第32-33页 |
| 2.2.4.4 TAIL-PCR分离突变体T-DNA侧翼序列 | 第33-34页 |
| 2.3 结果 | 第34-39页 |
| 2.3.1 尖孢镰刀菌对遗传霉素的敏感性 | 第34页 |
| 2.3.2 用于尖孢镰刀菌遗传转化的载体构建 | 第34-35页 |
| 2.3.3 根癌农杆菌介导的尖孢镰刀菌遗传转化的优化 | 第35-37页 |
| 2.3.3.1 共培养时间和温度对转化效率的影响 | 第35-36页 |
| 2.3.3.2 根癌农杆菌和尖孢镰刀菌分生孢子的比例对转化效率的影响 | 第36-37页 |
| 2.3.4 转化子遗传稳定性分析 | 第37-39页 |
| 2.3.4.1 尖孢镰刀菌转化子遗传霉素抗性遗传稳定性 | 第37页 |
| 2.3.4.2 T-DNA插入遗传稳定性分析 | 第37-38页 |
| 2.3.4.3 TAIL-PCR扩增T-DNA插入突变体侧翼序列 | 第38-39页 |
| 2.4 讨论 | 第39-40页 |
| 第3章 尖孢镰刀菌突变体库的筛选 | 第40-44页 |
| 3.1 材料 | 第40页 |
| 3.1.1 实验菌株 | 第40页 |
| 3.1.2 试剂耗材 | 第40页 |
| 3.1.3 仪器设备 | 第40页 |
| 3.2 实验方法 | 第40-42页 |
| 3.2.1 药物敏感性实验 | 第40-41页 |
| 3.2.2 药液配制 | 第41页 |
| 3.2.3 菌悬液的配制 | 第41页 |
| 3.2.4 微量药敏板的制备 | 第41页 |
| 3.2.5 结果判读 | 第41-42页 |
| 3.3 实验结果 | 第42页 |
| 3.3.1 药物敏感性改变菌株 | 第42页 |
| 3.4 讨论 | 第42-44页 |
| 第4章 尖孢镰刀菌唑类敏感突变体FOM1123分析 | 第44-60页 |
| 4.1 材料 | 第44-45页 |
| 4.1.1 实验菌株和质粒 | 第44页 |
| 4.1.2 引物 | 第44-45页 |
| 4.1.3 试剂耗材 | 第45页 |
| 4.1.4 仪器设备 | 第45页 |
| 4.2 方法 | 第45-51页 |
| 4.2.1 突变体FOM1123T-DNA插入位点分析 | 第45页 |
| 4.2.2 构建基因敲除株 | 第45-47页 |
| 4.2.2.1 目的基因上下游片段扩增 | 第46页 |
| 4.2.2.2 质粒提取 | 第46页 |
| 4.2.2.3 目的基因片段和质粒双酶切 | 第46-47页 |
| 4.2.2.4 质粒与目的基因片段的连接转化 | 第47页 |
| 4.2.2.5 基因敲除质粒的验证 | 第47页 |
| 4.2.2.6 根癌农杆菌感受态的制备及转化 | 第47页 |
| 4.2.2.7 根癌农杆菌介导尖孢镰刀菌转化方法 | 第47页 |
| 4.2.2.8 基因敲除株的验证 | 第47页 |
| 4.2.3 菌株药物敏感性实验 | 第47-48页 |
| 4.2.4 镰刀菌菌株生长速度和形态观察 | 第48页 |
| 4.2.5 FOXG_08274生物信息学分析 | 第48页 |
| 4.2.6 Real-timePCR分析麦角甾醇合成相关基因的表达 | 第48-50页 |
| 4.2.6.1 RNA提取： | 第48-49页 |
| 4.2.6.2 RNA反转录成cDNA | 第49-50页 |
| 4.2.6.3 实时荧光定量PCR | 第50页 |
| 4.2.7 麦角固醇含量测定 | 第50-51页 |
| 4.2.7.1 破壁萃取法测定浓度 | 第50-51页 |
| 4.2.7.2 麦角固醇标准曲线的绘制 | 第51页 |
| 4.2.7.3 麦角固醇含量的计算 | 第51页 |
| 4.3 结果 | 第51-58页 |
| 4.3.1 突变体FOM1123T-DNA插入位点分析 | 第51-52页 |
| 4.3.2 构建单基因敲除株 | 第52-54页 |
| 4.3.3 药物敏感性实验 | 第54页 |
| 4.3.4 菌株的生长速度和形态观察 | 第54-55页 |
| 4.3.5 CPR1生物信息学分析 | 第55-56页 |
| 4.3.6 Real-timePCR分析麦角甾醇合成相关基因的表达 | 第56-58页 |
| 4.3.7 麦角固醇含量测定 | 第58页 |
| 4.4 讨论 | 第58-60页 |
| 第5章 结论 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-66页 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67页 |
