| 中文摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-32页 |
| 1.1 血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI) | 第11-13页 |
| 1.2 非天然手性氨基酸 | 第13-17页 |
| 1.2.1 3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸 | 第13-15页 |
| 1.2.2 L-高苯丙氨酸 | 第15-17页 |
| 1.3 天冬氨酸转氨酶 | 第17-21页 |
| 1.3.1 天冬氨酸转氨酶催化机理 | 第17-19页 |
| 1.3.2 天冬氨酸转氨酶结构特点 | 第19页 |
| 1.3.3 对活性中心残基相关功能的研究 | 第19-21页 |
| 1.4 酶定向进化 | 第21-26页 |
| 1.4.1 非理性设计 | 第22-23页 |
| 1.4.2 半理性进化 | 第23-24页 |
| 1.4.3 理性进化 | 第24-26页 |
| 1.5 本研究目的与意义 | 第26-27页 |
| 参考文献 | 第27-32页 |
| 第二章 天冬氨酸转氨酶的定向进化及酶法合成L-苯丙氨酸衍生物 | 第32-53页 |
| 2.1 实验材料和仪器 | 第32-33页 |
| 2.1.1 菌种和质粒 | 第32页 |
| 2.1.2 主要实验仪器及设备 | 第32-33页 |
| 2.1.3 主要实验药品与试剂 | 第33页 |
| 2.1.4 培养基和展开剂 | 第33页 |
| 2.2 实验方法 | 第33-42页 |
| 2.2.1 化学法合成苯丙酮酸类似物 | 第33-35页 |
| 2.2.1.1 3-甲氧基苯丙酮酸钠的合成 | 第33-34页 |
| 2.2.1.2 4-甲氧基苯丙酮酸钠的合成 | 第34页 |
| 2.2.1.3 3,4-甲氧基苯丙酮酸的合成 | 第34-35页 |
| 2.2.2 天冬氨酸转氨酶的定向进化 | 第35-38页 |
| 2.2.2.1 突变文库的构建 | 第35-37页 |
| 2.2.2.2 突变文库的筛选 | 第37-38页 |
| 2.2.3 重组蛋白的诱导表达与分离纯化 | 第38-39页 |
| 2.2.3.1 重组蛋白的诱导表达 | 第38页 |
| 2.2.3.2 重组蛋白的分离纯化 | 第38-39页 |
| 2.2.4 蛋白的浓度测定 | 第39页 |
| 2.2.5 纯化酶蛋白活性测定方法 | 第39页 |
| 2.2.6 酶促反应动力学参数测定 | 第39-41页 |
| 2.2.6.1 米氏常数(Km) | 第39-40页 |
| 2.2.6.2 最大反应速度Vmax | 第40页 |
| 2.2.6.3 kcat | 第40-41页 |
| 2.2.6.4 kcat/Km | 第41页 |
| 2.2.6.5 酶的热稳定性 | 第41页 |
| 2.2.6.6 酶的pH稳定性 | 第41页 |
| 2.2.7 柱前衍生拆分对映异构体 | 第41-42页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第42-51页 |
| 2.3.1 建立易错-PCR突变文库 | 第42-43页 |
| 2.3.1.1 重组pET-28a-AspAT质粒的构建 | 第42-43页 |
| 2.3.1.2 突变文库的构建 | 第43页 |
| 2.3.2 突变体文库筛选 | 第43-44页 |
| 2.3.3 316位精氨酸定点突变分析 | 第44-46页 |
| 2.3.4 野生菌株与突变体的活性对比 | 第46-47页 |
| 2.3.5 重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析 | 第47页 |
| 2.3.6 酶促反应动力学分析 | 第47-51页 |
| 2.3.6.1 酶促反应动力学参数 | 第47-48页 |
| 2.3.6.2 重组酶的热稳定性 | 第48-49页 |
| 2.3.6.3 重组酶的pH稳定性 | 第49页 |
| 2.3.6.4 产物光学纯度分析 | 第49-51页 |
| 2.4 本章小结 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-53页 |
| 第三章 天冬氨酸转氨酶的定向进化及酶法合成L-高苯丙氨酸 | 第53-61页 |
| 3.1 实验材料和仪器 | 第53页 |
| 3.2 实验方法 | 第53-54页 |
| 3.2.1 天冬氨酸转氨酶的定向进化 | 第53页 |
| 3.2.2 重组蛋白的诱导表达与分离纯化 | 第53页 |
| 3.2.3 蛋白的浓度测定 | 第53-54页 |
| 3.2.4 酶活性测定方法 | 第54页 |
| 3.2.5 酶学性质测定 | 第54页 |
| 3.3 实验结果与讨论 | 第54-59页 |
| 3.3.1 建立易错-PCR突变文库 | 第54-55页 |
| 3.3.1.1 重组pET-28a-AspAT质粒的构建 | 第54-55页 |
| 3.3.1.2 突变文库的构建 | 第55页 |
| 3.3.2 突变体文库筛选 | 第55-56页 |
| 3.3.3 重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析 | 第56-57页 |
| 3.3.4 酶促反应动力学参数 | 第57页 |
| 3.3.5 产物光学纯度分析 | 第57-59页 |
| 3.4 本章小结 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-61页 |
| 第四章 实验室规模制备3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸和L-高苯丙氨酸 | 第61-69页 |
| 4.1 实验材料和仪器 | 第61页 |
| 4.2 实验方法 | 第61-62页 |
| 4.2.1 突变体75c催化合成3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸条件优化 | 第61-62页 |
| 4.2.1.1 突变体75c的发酵罐培养 | 第61页 |
| 4.2.1.2 催化反应条件优化 | 第61-62页 |
| 4.2.2 突变体22催化合成L-高苯丙氨酸条件优化 | 第62页 |
| 4.3 实验结果 | 第62-67页 |
| 4.3.1 最适温度 | 第62-63页 |
| 4.3.2 最适pH | 第63页 |
| 4.3.3 最适底物浓度 | 第63-64页 |
| 4.3.4 底物物质的量比的影响 | 第64-65页 |
| 4.3.5 实验室规模制备3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸 | 第65-66页 |
| 4.3.6 实验室规模制备L-高苯丙氨酸 | 第66-67页 |
| 4.4 本章小结 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-69页 |
| 总结与展望 | 第69-71页 |
| 附录A 大肠杆菌天冬氨酸转氨酶基因和蛋白序列 | 第71-72页 |
| 附录B 实验仪器和材料 | 第72-74页 |
| 附录C 部分化合物的C~(13) NMR,H~1 NMR | 第74-81页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文与申请专利 | 第81-82页 |
| 致谢 | 第82-83页 |
