| 中文摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 1 引言 | 第11-21页 |
| 1.1 小花棘豆研究概况 | 第11-12页 |
| 1.1.1 小花棘豆的生物学和生态学特征 | 第11页 |
| 1.1.2 小花棘豆的危害、防治及利用 | 第11-12页 |
| 1.2 疯草内生真菌研究概况 | 第12-13页 |
| 1.3 苦马豆素研究 | 第13-16页 |
| 1.3.1 苦马豆素的来源及其理化性质 | 第13-14页 |
| 1.3.2 苦马豆素毒性及应用前景 | 第14-15页 |
| 1.3.3 苦马豆素的分离提取及检测 | 第15-16页 |
| 1.4 酵母氨酸还原酶基因 | 第16-18页 |
| 1.4.1 酵母氨酸还原酶基因简介 | 第16-17页 |
| 1.4.2 酵母氨酸还原酶基因与苦马豆素的关系 | 第17-18页 |
| 1.5 简并PCR及RACE技术 | 第18-19页 |
| 1.5.1 简并PCR技术及应用 | 第18-19页 |
| 1.5.2 RACE技术的简介及应用 | 第19页 |
| 1.6 基因敲除载体构建 | 第19-20页 |
| 1.7 研究目的与意义 | 第20-21页 |
| 2 材料与方法 | 第21-47页 |
| 2.1 真菌材料 | 第21页 |
| 2.2 试剂及培养基 | 第21-23页 |
| 2.2.1 试剂 | 第21页 |
| 2.2.2 主要试剂及培养基配制 | 第21-23页 |
| 2.3 仪器设备及实验器具无RNA酶处理 | 第23页 |
| 2.4 实验方法 | 第23-39页 |
| 2.4.1 单株小花棘豆内生真菌的接种及培养 | 第23-25页 |
| 2.4.1.1 PDA培养基配制 | 第23页 |
| 2.4.1.2 小花棘豆内生真菌接种 | 第23-24页 |
| 2.4.1.3 单株小花棘豆内生真菌基因组DNA提取 | 第24页 |
| 2.4.1.4 小花棘豆内生真菌5.8SrDNA/ITS区的序列扩增 | 第24-25页 |
| 2.4.2 小花棘豆内生真菌酵母氨酸还原酶基因中间片段克隆 | 第25-26页 |
| 2.4.2.1 简并PCR扩增酵母氨酸还原酶基因中间片段 | 第25-26页 |
| 2.4.2.2 PCR产物纯化并测序 | 第26页 |
| 2.4.3 3'RACE法扩增酵母氨酸还原酶基因cDNA3'末端序列 | 第26-32页 |
| 2.4.3.1 小花棘豆内生真菌总RNA提取 | 第26-27页 |
| 2.4.3.2 总RNA浓度的检测 | 第27页 |
| 2.4.3.3 含有3'Adaptor的cDNA第一条链合成 | 第27-29页 |
| 2.4.3.4 PCR产物胶回收 | 第29-30页 |
| 2.4.3.5 3'RACE的PCR产物克隆 | 第30-31页 |
| 2.4.3.6 克隆产物检测 | 第31-32页 |
| 2.4.4 5'RACE法扩增酵母氨酸还原酶基因cDNA5'末端序列 | 第32-37页 |
| 2.4.4.1 小花棘豆内生真菌总RNA提取 | 第32-33页 |
| 2.4.4.2 含有5'Adaptor的cDNA第一条链合成 | 第33-35页 |
| 2.4.4.3 套式PCR反应扩增cDNA5'末端序列 | 第35-36页 |
| 2.4.4.4 5'RACE的PCR产物克隆测序 | 第36-37页 |
| 2.4.5 酵母氨酸还原酶基因全长cDNA扩增 | 第37-38页 |
| 2.4.5.1 小花棘豆内生真菌cDNA合成 | 第37页 |
| 2.4.5.2 酵母氨酸还原酶基因cDNA扩增 | 第37-38页 |
| 2.4.6 酵母氨酸还原酶基因扩增 | 第38-39页 |
| 2.4.6.1 模板制备及引物设计 | 第38页 |
| 2.4.6.2 酵母氨酸还原酶基因扩增 | 第38-39页 |
| 2.4.6.3 酵母氨酸还原酶基因克隆与测序 | 第39页 |
| 2.5 酵母氨酸还原酶基因缺失载体构建 | 第39-47页 |
| 2.5.1 引物设计 | 第39-40页 |
| 2.5.2 载体构建过程 | 第40-42页 |
| 2.5.2.1 酵母氨酸还原酶基因上游目的片段扩增 | 第40页 |
| 2.5.2.2 酵母氨酸还原酶基因下游目的片段的扩增 | 第40-41页 |
| 2.5.2.3 hph基因扩增 | 第41-42页 |
| 2.5.3 目的片段与载体的酶切 | 第42-44页 |
| 2.5.3.1 上游目的片段的酶切 | 第42页 |
| 2.5.3.2 下游目的片段的酶切反应 | 第42-43页 |
| 2.5.3.3 hph基因的酶切 | 第43页 |
| 2.5.3.4 pUC19质粒酶切反应 | 第43-44页 |
| 2.5.4 重组载体构建及转化 | 第44-47页 |
| 2.5.4.1 三段目的片段连接 | 第44-45页 |
| 2.5.4.2 连接后的目的片段与载体连接 | 第45页 |
| 2.5.4.3 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备 | 第45页 |
| 2.5.4.4 重组载体与大肠杆菌DH5α转化 | 第45-46页 |
| 2.5.4.5 重组载体的筛选及鉴定 | 第46-47页 |
| 3 结果与分析 | 第47-63页 |
| 3.1 小花棘豆内生真菌的研究 | 第47-50页 |
| 3.1.1 小花棘豆内生真菌的培养 | 第47-48页 |
| 3.1.2 小花棘豆内生真菌的总DNA提取 | 第48-49页 |
| 3.1.3 小花棘豆内生真菌5.8SrDNA/ITS序列测定 | 第49-50页 |
| 3.2 小花棘豆Embellisia内生真菌酵母氨酸还原酶基因cDNA克隆 | 第50-56页 |
| 3.2.1 小花棘豆Embellisia内生真菌酵母氨酸还原酶基因中间片段克隆 | 第50-51页 |
| 3.2.2 小花棘豆Embellisia内生真菌酵母氨酸还原酶基因cDNA3'RACE产物的克隆与测序 | 第51-53页 |
| 3.2.2.1 OW7.8总RNA提取结果 | 第51页 |
| 3.2.2.2 3'RACE产物的克隆与测序 | 第51-53页 |
| 3.2.3 小花棘豆Embellisia内生真菌酵母氨酸还原酶基因cDNA5'RACE产物的克隆与测序 | 第53-54页 |
| 3.2.4 RACE获得小花棘豆Embellisia内生真菌酵母氨酸还原酶基因cDNA | 第54页 |
| 3.2.5 小花棘豆Embellisia内生真菌酵母氨酸还原酶基因cDNA扩增测序验证 | 第54-55页 |
| 3.2.6 小花棘豆Embellisia内生真菌酵母氨酸还原酶基因扩增 | 第55-56页 |
| 3.3 小花棘豆Embellisia内生真菌酵母氨酸还原酶基因缺失载体构建 | 第56-63页 |
| 3.3.1 目的片段扩增 | 第56-57页 |
| 3.3.1.1 酵母氨酸还原酶基因上游目的片段扩增 | 第56页 |
| 3.3.1.2 酵母氨酸还原酶基因下游目的片段扩增 | 第56-57页 |
| 3.3.1.3 hph基因扩增 | 第57页 |
| 3.3.2 目的片段及pUC19质粒酶切反应 | 第57-59页 |
| 3.3.2.1 目的片段第一次酶切及pUC19质粒双酶切 | 第57-58页 |
| 3.3.2.2 目的片段第二次酶切 | 第58-59页 |
| 3.3.3 目的片段与pUC19质粒连接 | 第59-63页 |
| 3.3.3.1 目的片段连接及检测 | 第59页 |
| 3.3.3.2 纯化后连接的目的片段酶切 | 第59-60页 |
| 3.3.3.3 目的片段与载体的连接及转化 | 第60-61页 |
| 3.3.3.4 重组载体检测 | 第61-62页 |
| 3.3.3.5 重组载体图谱 | 第62-63页 |
| 4 讨论与结论 | 第63-67页 |
| 4.1 体外培养的小花棘豆Embellisia内生真菌的研究及鉴定 | 第63-64页 |
| 4.2 苦马豆素与小花棘豆Embellisia内生真菌关系 | 第64页 |
| 4.3 小花棘豆Embellisia内生真菌酵母氨酸还原酶基因cDNA序列的克隆 | 第64-65页 |
| 4.4 小花棘豆Embellisia内生真菌酵母氨酸还原酶基因序列 | 第65-66页 |
| 4.5 小花棘豆Embellisia内生真菌酵母氨酸还原酶基因缺失载体构建 | 第66页 |
| 4.6 结论 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-73页 |
| 附录1 | 第73-74页 |
| 附录2 | 第74-75页 |
| 附录3 | 第75-77页 |
| 附录4 | 第77-79页 |
| 附录5 | 第79-80页 |
| 致谢 | 第80-81页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第81页 |
| 论文资助项目 | 第81页 |
