| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 缩略语表 | 第12-13页 |
| 氨基酸及其缩写 | 第13-14页 |
| 第1章 文献综述 | 第14-25页 |
| 1 抗菌肽的分类 | 第14页 |
| 2 抗菌肽的结构与功能 | 第14-16页 |
| 2.1 α螺旋型抗菌肽 | 第14-15页 |
| 2.2 β折叠型抗菌肽 | 第15页 |
| 2.3 环状型抗菌肽 | 第15-16页 |
| 2.4 线型抗菌肽 | 第16页 |
| 2.4.1 富含脯氨酸抗菌肽 | 第16页 |
| 2.4.2 富含甘氨酸抗菌肽 | 第16页 |
| 3 抗菌肽的生物学功能 | 第16-21页 |
| 3.1 具有广谱抗菌活性 | 第17-18页 |
| 3.2 具有抗病毒作用 | 第18-19页 |
| 3.2.1 HSV | 第18页 |
| 3.2.2 HIV | 第18-19页 |
| 3.2.3 IVA | 第19页 |
| 3.3 具有抗原虫作用 | 第19-20页 |
| 3.4 抗肿瘤活性 | 第20页 |
| 3.5 免疫佐剂 | 第20-21页 |
| 4 鱼类抗菌肽其他方面的研究进展 | 第21页 |
| 5 抗菌肽基因的表达策略 | 第21-24页 |
| 5.1 原核表达系统 | 第21-22页 |
| 5.2 真核表达系统 | 第22-24页 |
| 5.2.1 哺乳动物细胞表达系统 | 第22页 |
| 5.2.2 杆状病毒表达系统 | 第22页 |
| 5.2.3 巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第22-24页 |
| 6 本研究的目的,意义及内容 | 第24-25页 |
| 第2章 中华鲟抗菌肽hepcidin的克隆、表达及其抗菌活性分析 | 第25-57页 |
| 1 材料 | 第27-29页 |
| 1.1 实验鱼 | 第27页 |
| 1.2 菌体与载体 | 第27页 |
| 1.2 实验试剂 | 第27页 |
| 1.3 溶液与培养基 | 第27-28页 |
| 1.4 实验仪器 | 第28-29页 |
| 1.5 引物 | 第29页 |
| 2 方法 | 第29-40页 |
| 2.1 中华鲟hepcidin的PCR扩增、克隆与鉴定 | 第29-32页 |
| 2.1.1 实验鱼的处理 | 第29页 |
| 2.1.2 Trizol法提取总RNA | 第29-30页 |
| 2.1.3 cDNA第一条链的合成及PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2.1.4 PCR产物回收与纯化 | 第31页 |
| 2.1.5 目的基因的克隆与筛选 | 第31-32页 |
| 2.1.6 重组质粒的PCR鉴定 | 第32页 |
| 2.1.7 基因序列的测定与分析 | 第32页 |
| 2.2 重组真核表达载体pPICZαA-hepcidin的构建 | 第32-36页 |
| 2.2.1 目的基因的PCR扩增 | 第32-33页 |
| 2.2.2 PCR产物回收与纯化 | 第33页 |
| 2.2.3 目的基因的克隆与筛选 | 第33页 |
| 2.2.4 重组质粒的鉴定 | 第33页 |
| 2.2.5 基因序列的测定与分析 | 第33页 |
| 2.2.6 pMD19-hepcidin质粒与表达载体pPICZαA的分步双酶切 | 第33-34页 |
| 2.2.7 目的基因与真核表达载体的连接 | 第34页 |
| 2.2.8 重组质粒的转化 | 第34-35页 |
| 2.2.9 重组真核表达质粒的PCR鉴定 | 第35页 |
| 2.2.10 测序鉴定与分析 | 第35-36页 |
| 2.3 重组真核表达载体在毕赤酵母中的表达与抗菌活性分析 | 第36-40页 |
| 2.3.1 重组表达质粒pPICZαA-hepcidin的提取 | 第36页 |
| 2.3.2 重组质粒的线性化 | 第36页 |
| 2.3.3 酵母感受态细胞的制备 | 第36-37页 |
| 2.3.4 线性化重组质粒电转化酵母感受态细胞 | 第37页 |
| 2.3.5 阳性酵母菌落的筛选 | 第37-38页 |
| 2.3.6 高拷贝阳性菌株的诱导表达 | 第38页 |
| 2.3.7 体外抑菌实验 | 第38-39页 |
| 2.3.8 重组抗菌肽hepcidin的抑菌效价测定 | 第39页 |
| 2.3.9 重组抗菌肽hepcidin的杀菌效价测定 | 第39页 |
| 2.3.10 重组抗菌肽hepcidin的热稳定性检测 | 第39-40页 |
| 3 结果 | 第40-52页 |
| 3.1 中华鲟hepcidin基因的鉴定 | 第40-41页 |
| 3.1.1 中华鲟RNA提取结果 | 第40页 |
| 3.1.2 中华鲟hepcidin基因的RT-PCR结果 | 第40-41页 |
| 3.1.3 中华鲟hepcidin基因的菌液PCR鉴定 | 第41页 |
| 3.1.4 中华鲟hepcidin基因的测序鉴定 | 第41页 |
| 3.2 中华鲟hepcidin真核表达载体的构建 | 第41-44页 |
| 3.2.1 重组表达质粒pPICZαA-hepcidin的双酶切结果 | 第41-43页 |
| 3.2.2 重组真核表达质粒的PCR鉴定 | 第43-44页 |
| 3.2.3 重组真核表达质粒的测序鉴定 | 第44页 |
| 3.3 中华鲟hepcidin基因的序列分析 | 第44-46页 |
| 3.3.1 中华鲟hepcidin核苷酸序列同源性分析 | 第44页 |
| 3.3.2 中华鲟hepcidin核苷酸序列构建系统发育树 | 第44-45页 |
| 3.3.3 表达载体的构建及测序结果分析 | 第45-46页 |
| 3.4 重组质粒pPICZαA-hepcidin的线性化 | 第46-47页 |
| 3.5 阳性重组酵母菌落的PCR鉴定 | 第47页 |
| 3.6 生物学活性检测 | 第47-52页 |
| 3.6.1 表达产物抗菌活性检测 | 第47-50页 |
| 3.6.2 重组抗菌肽hepcidin的抑菌效价 | 第50-51页 |
| 3.6.3 重组抗菌肽hepcidin的杀菌效价 | 第51页 |
| 3.6.4 重组抗菌肽hepcidin的热稳定性 | 第51-52页 |
| 4 讨论 | 第52-57页 |
| 4.1 引物设计与载体的选择 | 第53页 |
| 4.2 EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切位点的选择 | 第53-54页 |
| 4.3 目的基因内部结构对表达量的影响 | 第54页 |
| 4.4 诱导时间、温度和甲醇浓度对酵母表达的影响 | 第54页 |
| 4.5 重组抗菌肽hepcidin生物活性的测定 | 第54-57页 |
| 参考文献 | 第57-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 硕士期间论文发表情况 | 第68-69页 |
| 附录 | 第69-72页 |
