| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 1. 文献综述 | 第13-26页 |
| 1.1 脂肪酶 | 第13-18页 |
| 1.1.1 脂肪酶的定义与来源 | 第13-14页 |
| 1.1.2 脂肪酶工业应用的研究现状 | 第14-16页 |
| 1.1.3 脂肪酶对油脂水解的催化作用 | 第16-18页 |
| 1.2 脂肪酶的表达及其相关性能研究 | 第18-21页 |
| 1.2.1 脂肪酶在大肠杆菌中的可溶性表达 | 第18-19页 |
| 1.2.2 脂肪酶的前导肽对其表达的影响 | 第19页 |
| 1.2.3 微生物脂肪酶的最适pH值与最适温度 | 第19-20页 |
| 1.2.4 微生物脂肪酶的耐热性 | 第20-21页 |
| 1.3 定向进化技术的原理和应用 | 第21-24页 |
| 1.3.1 定向进化技术的原理 | 第21页 |
| 1.3.2 酶定向进化的步骤 | 第21-22页 |
| 1.3.3 酶定向进化突变体文库的建立 | 第22-23页 |
| 1.3.3.1 非重组方法构建突变库 | 第22页 |
| 1.3.3.2 重组方法构建突变库 | 第22-23页 |
| 1.3.3.3 其他突变文库的建立方法 | 第23页 |
| 1.3.4 定向进化中高通量筛选模型的建立 | 第23-24页 |
| 1.3.5 定向进化技术的展望 | 第24页 |
| 1.4 课题研究内容与意义 | 第24-26页 |
| 2. 脂肪酶RML的克隆、表达及其活性测定 | 第26-46页 |
| 2.1 材料与方法 | 第26-37页 |
| 2.1.1 材料 | 第26-27页 |
| 2.1.1.1 目的基因、菌株与质粒 | 第26-27页 |
| 2.1.1.2 工具酶 | 第27页 |
| 2.1.1.3 试剂 | 第27页 |
| 2.1.1.4 主要仪器 | 第27页 |
| 2.1.2 实验方法 | 第27-37页 |
| 2.1.2.1 琼脂糖凝胶电泳 | 第27-28页 |
| 2.1.2.2 大肠杆菌K12基因组的提取 | 第28页 |
| 2.1.2.3 质粒的提取与纯化 | 第28页 |
| 2.1.2.4 扩增目的基因的引物设计 | 第28-30页 |
| 2.1.2.5 PCR反应体系及程序设置 | 第30页 |
| 2.1.2.6 脂肪酶基因的纯化、酶切以及与载体的连接 | 第30-31页 |
| 2.1.2.7 大肠杆菌BL21普通感受态的制备以及转化 | 第31-32页 |
| 2.1.2.8 重组子的鉴定 | 第32页 |
| 2.1.2.9 目标蛋白的诱导表达 | 第32-33页 |
| 2.1.2.10 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第33-35页 |
| 2.1.2.11 Bradford法测定蛋白浓度 | 第35页 |
| 2.1.2.12 目标蛋白的纯化 | 第35-36页 |
| 2.1.2.13 脂肪酶活性的测定 | 第36-37页 |
| 2.2 结果 | 第37-44页 |
| 2.2.1 重组子的克隆 | 第37-38页 |
| 2.2.2 pET30a-pro-RML的常温诱导及低温诱导表达 | 第38-39页 |
| 2.2.3 pET30a-Skp-pro-RML和pET32a-pro-RML的常温诱导表达 | 第39-40页 |
| 2.2.4 脂肪酶RML的前导肽对其表达的影响 | 第40-42页 |
| 2.2.4.1 重组子pET30a-pro-RML和pET30a-RML的克隆 | 第40-41页 |
| 2.2.4.2 重组子pET30a-pro-RML和pET30a-RML的低温诱导表达 | 第41-42页 |
| 2.2.5 蛋白的纯化及比活测定 | 第42-44页 |
| 2.3 讨论 | 第44-46页 |
| 3. 利用定向进化策略提高RML活性和热稳定性的研究 | 第46-64页 |
| 3.1 材料与方法 | 第46-55页 |
| 3.1.1 材料 | 第46-47页 |
| 3.1.1.1 菌株、重组质粒和工具酶 | 第46-47页 |
| 3.1.1.2 所需试剂 | 第47页 |
| 3.1.1.3 主要设备 | 第47页 |
| 3.1.2 实验方法 | 第47-55页 |
| 3.1.2.1 BL21超级感受态的制备 | 第47-48页 |
| 3.1.2.2 易错PCR与突变文库的建立 | 第48页 |
| 3.1.2.3 RML脂肪酶突变体的诱导表达 | 第48-49页 |
| 3.1.2.4 突变体对油脂催化活性的初筛(高通量筛选方法的建立) | 第49-50页 |
| 3.1.2.5 突变体对油脂催化活性的复筛 | 第50页 |
| 3.1.2.6 感受态细胞DH5a的制备 | 第50-51页 |
| 3.1.2.7 定点突变和定点饱和突变 | 第51-53页 |
| 3.1.2.8 突变体PCR产物的纯化与野生型模板的消化 | 第53页 |
| 3.1.2.9 突变体的转化 | 第53-54页 |
| 3.1.2.10 定点突变阳性克隆的鉴定 | 第54-55页 |
| 3.1.2.11 定点饱和突变体库的高通量筛选 | 第55页 |
| 3.2 实验结果 | 第55-62页 |
| 3.2.1 易错PCR Mn~(2+)浓度的选择 | 第55-56页 |
| 3.2.2 利用定向进化策略提高RML活性和耐热性的流程 | 第56-57页 |
| 3.2.3 15株RML突变体水解比活和耐热性测定结果 | 第57-59页 |
| 3.2.4 定点突变和饱和突变的点选择依据 | 第59-62页 |
| 3.3 讨论 | 第62-64页 |
| 4. 脂肪酶RML的前导肽在酶定向进化中所起的作用 | 第64-72页 |
| 4.1 材料与方法 | 第64-66页 |
| 4.1.1 材料 | 第64-65页 |
| 4.1.2 实验方法 | 第65-66页 |
| 4.1.2.1 多位点突变的突变体中单点突变效果分析 | 第65-66页 |
| 4.1.2.2 突变体测序及活性检测 | 第66页 |
| 4.1.2.3 前导肽二级结构同源性的比较 | 第66页 |
| 4.2 实验结果 | 第66-71页 |
| 4.2.1 前导肽对高活性突变体的作用分析 | 第66-69页 |
| 4.2.2 前导肽突变影响蛋白活性的机理探究 | 第69-71页 |
| 4.3 结论 | 第71-72页 |
| 5. 总结与展望 | 第72-75页 |
| 5.1 总结 | 第72-74页 |
| 5.2 展望 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-80页 |
| 附录 | 第80-86页 |
