| 学位论文数据集 | 第3-4页 |
| 摘要 | 第4-8页 |
| ABSTRACT | 第8-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-53页 |
| 1.1 脂肪酶简介 | 第16-17页 |
| 1.2 微生物脂肪酶的生产 | 第17-20页 |
| 1.3 微生物脂肪酶的纯化和性质 | 第20-24页 |
| 1.3.1 细菌脂肪酶的纯化 | 第20-21页 |
| 1.3.2 酵母脂肪酶的纯化 | 第21-22页 |
| 1.3.3 真菌脂肪酶的纯化 | 第22-24页 |
| 1.4 微生物脂肪酶基因的克隆 | 第24-29页 |
| 1.4.1 真菌脂肪酶 | 第24-27页 |
| 1.4.2 细菌脂肪酶 | 第27-29页 |
| 1.5 脂肪酶的重组表达 | 第29-33页 |
| 1.5.1 表达系统的比较 | 第29-31页 |
| 1.5.1.1 原核表达系统 | 第29-30页 |
| 1.5.1.2 真核表达系统 | 第30-31页 |
| 1.5.2 前肽对表达的影响 | 第31-32页 |
| 1.5.3 遗传密码识别的差异 | 第32页 |
| 1.5.4 N-糖基化对脂肪酶的影响 | 第32-33页 |
| 1.6 脂肪酶的空间结构 | 第33-37页 |
| 1.7 脂肪酶的应用 | 第37-39页 |
| 1.8 本课题的设计思路和研究内容 | 第39页 |
| 参考文献 | 第39-53页 |
| 第二章 Candida sp.99-125胞外脂肪酶的分离纯化和性质分析 | 第53-82页 |
| 2.1 前言 | 第53页 |
| 2.2 材料和方法 | 第53-63页 |
| 2.2.1 材料和设备 | 第53-54页 |
| 2.2.2 试验方法 | 第54-63页 |
| 2.2.2.1 脂肪酶活性的测定 | 第54页 |
| 2.2.2.2 蛋白质浓度测定 | 第54-55页 |
| 2.2.2.3 粗酶粉的制备 | 第55页 |
| 2.2.2.4 离子交换层析 | 第55-56页 |
| 2.2.2.5 疏水层析 | 第56页 |
| 2.2.2.6 超滤 | 第56页 |
| 2.2.2.7 脂肪酶糖基化分析 | 第56-57页 |
| 2.2.2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第57页 |
| 2.2.2.9 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) | 第57-58页 |
| 2.2.2.10 脂肪酶等电聚焦分析 | 第58-59页 |
| 2.2.2.11 橄榄油—罗丹明(Rhodamine)平板脂肪酶活性分析 | 第59页 |
| 2.2.2.12 双向电泳 | 第59-60页 |
| 2.2.2.13 N—末端氨基酸残基的测定 | 第60-61页 |
| 2.2.2.14 脂肪酶的MALDI—TOF质谱检测 | 第61-62页 |
| 2.2.2.15 温度对脂肪酶活性和稳定性的影响 | 第62页 |
| 2.2.2.16 pH对脂肪酶活性和稳定性的影响 | 第62页 |
| 2.2.2.17 有机溶剂对脂肪酶活性的影响 | 第62-63页 |
| 2.2.2.18 不同的金属离子对脂肪酶活性的影响 | 第63页 |
| 2.2.2.19 不同表面活性剂和酶抑制剂对脂肪酶活性的影响 | 第63页 |
| 2.2.2.20 脂肪酶对几种油脂的活性 | 第63页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第63-80页 |
| 2.3.1 脂肪酶的分离纯化 | 第63-68页 |
| 2.3.1.1 粗酶粉的制备 | 第63页 |
| 2.3.1.2 离子交换层析 | 第63-65页 |
| 2.3.1.3 疏水层析 | 第65-68页 |
| 2.3.2 脂肪酶同工酶的鉴定和分离 | 第68-70页 |
| 2.3.2.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) | 第68页 |
| 2.3.2.2 等电聚焦电泳(IEF) | 第68-69页 |
| 2.3.2.3 双向电泳 | 第69-70页 |
| 2.3.3 脂肪酶同工酶的原因分析 | 第70-75页 |
| 2.3.3.1 N—端氨基酸的测序 | 第70页 |
| 2.3.3.2 MALDI—TOF质谱分析 | 第70-73页 |
| 2.3.3.3 脂肪酶N—糖基化分析 | 第73-75页 |
| 2.3.4 脂肪酶的性质 | 第75-80页 |
| 2.3.4.1 温度对脂肪酶活性和稳定的影响 | 第75-76页 |
| 2.3.4.2 pH对脂肪酶活性和稳定性的影响 | 第76-77页 |
| 2.3.4.3 极性有机溶剂对脂肪酶活性的影响 | 第77-78页 |
| 2.3.4.4 不同金属离子对脂肪酶活性的影响 | 第78页 |
| 2.3.4.5 表面活性剂和抑制剂对脂肪酶活性的影响 | 第78-79页 |
| 2.3.4.6 脂肪酶对几种油脂的活性 | 第79-80页 |
| 2.4 小结 | 第80页 |
| 参考文献 | 第80-82页 |
| 第三章 Candida sp.99—125胞外脂肪酶基因的克隆和在毕赤酵母中的表达 | 第82-113页 |
| 3.1 前言 | 第82页 |
| 3.2 材料与方法 | 第82-96页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第82页 |
| 3.2.2 试剂和试剂盒 | 第82-83页 |
| 3.2.3 培养基 | 第83页 |
| 3.2.4 试验方法 | 第83-96页 |
| 3.2.4.1 酵母基因组的提取 | 第83-84页 |
| 3.2.4.2 PCR扩增脂肪酶基因 | 第84-85页 |
| 3.2.4.3 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 | 第85-86页 |
| 3.2.4.4 重组质粒pPICZaA-CLlip的构建 | 第86-87页 |
| 3.2.4.5 重组质粒的大肠杆菌电转化 | 第87-88页 |
| 3.2.4.6 大肠杆菌阳性克隆的筛选 | 第88-89页 |
| 3.2.4.7 重组质粒序列分析 | 第89页 |
| 3.2.4.8 重组质粒的酶切线性化 | 第89-90页 |
| 3.2.4.9 毕赤酵母感受态细胞制备 | 第90页 |
| 3.2.4.10 毕赤酵母电转化 | 第90-91页 |
| 3.2.4.11 高浓度抗生素平板筛选 | 第91页 |
| 3.2.4.12 产脂肪酶重组子的平板筛选 | 第91页 |
| 3.2.4.13 产脂肪酶重组子的摇瓶筛选 | 第91-92页 |
| 3.2.4.14 生物量的测定 | 第92页 |
| 3.2.4.15 脂肪酶活性测定 | 第92页 |
| 3.2.4.16 重组蛋白的SDS-PAGE分析 | 第92-93页 |
| 3.2.4.17 Southern Blot杂交分析 | 第93-95页 |
| 3.2.4.18 生物信息学分析所用的软件和网址 | 第95-96页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第96-111页 |
| 3.3.1 胞外脂肪酶基因(ClLip)的克隆 | 第96-97页 |
| 3.3.1.1 Candida sp.99—125基因组的提取 | 第96页 |
| 3.3.1.2 ClLip基因的PCR扩增 | 第96-97页 |
| 3.3.1.3 重组子的筛选和鉴定 | 第97页 |
| 3.3.2 ClLip序列分析 | 第97-101页 |
| 3.3.3 ClLip空间结构的模拟 | 第101-102页 |
| 3.3.4 毕赤酵母表达ClLip脂肪酶 | 第102-111页 |
| 3.3.4.1 重组酵母产脂肪酶平板筛选 | 第102-104页 |
| 3.3.4.2 重组酵母产脂肪酶的摇瓶筛选 | 第104-107页 |
| 3.3.4.3 2L摇瓶中脂肪酶的诱导表达 | 第107-109页 |
| 3.3.4.4 Southern blot分析 | 第109-111页 |
| 3.4 小结 | 第111-112页 |
| 参考文献 | 第112-113页 |
| 第四章 重组脂肪酶的毕赤酵母发酵生产、纯化以及性质分析 | 第113-135页 |
| 4.1 前言 | 第113页 |
| 4.2 材料和方法 | 第113-118页 |
| 4.2.1 菌种 | 第113页 |
| 4.2.2 材料和设备 | 第113-114页 |
| 4.2.3 培养基 | 第114页 |
| 4.2.4 试验方法 | 第114-118页 |
| 4.2.4.1 发酵种子液的培养 | 第114页 |
| 4.2.4.2 通过溶氧控制发酵过程 | 第114-115页 |
| 4.2.4.3 恒定甲醇浓度的发酵过程 | 第115页 |
| 4.2.4.4 菌体生长情况监测 | 第115页 |
| 4.2.4.5 重组脂肪酶rClLip的分离纯化 | 第115-116页 |
| 4.2.4.6 温度和pH对重组脂肪酶活性和稳定性的影响 | 第116页 |
| 4.2.4.7 重组脂肪酶的底物特异性 | 第116-117页 |
| 4.2.4.8 重组脂肪酶酯化选择性 | 第117-118页 |
| 4.2.4.9 重组脂肪酶的去糖基化分析 | 第118页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第118-131页 |
| 4.3.1 溶氧控制甲醇流加发酵生产脂肪酶rClLip | 第118-121页 |
| 4.3.2 恒定甲醇浓度的发酵过程 | 第121-125页 |
| 4.3.3 重组脂肪酶rClLip分离纯化 | 第125-126页 |
| 4.3.4 重组脂肪酶rClLip性质分析 | 第126-131页 |
| 4.3.4.1 温度对rClLip的活性和稳定性的影响 | 第126-127页 |
| 4.3.4.2 pH对rClLip活性和稳定性的影响 | 第127-128页 |
| 4.3.4.3 rClLip的底物特异性 | 第128-129页 |
| 4.3.4.4 酯化选择性 | 第129-130页 |
| 4.3.4.5 重组脂肪酶的N-糖基化分析 | 第130-131页 |
| 4.4 rClLip与ClLip性质的比较 | 第131-133页 |
| 4.5 小结 | 第133页 |
| 参考文献 | 第133-135页 |
| 第五章 N-糖基化对脂肪酶分泌和酶学性质的影响 | 第135-150页 |
| 5.1 前言 | 第135页 |
| 5.2 材料和方法 | 第135-140页 |
| 5.2.1 菌种与质粒 | 第135页 |
| 5.2.2 试剂和试剂盒 | 第135-136页 |
| 5.2.3 培养基 | 第136页 |
| 5.2.4 引物 | 第136-137页 |
| 5.2.5 试验方法 | 第137-140页 |
| 5.2.5.1 脂肪酶基因的定点突变 | 第137-139页 |
| 5.2.5.2 突变基因的重组质粒的构建 | 第139页 |
| 5.2.5.3 重组质粒的大肠杆菌电转化 | 第139页 |
| 5.2.5.4 重组质粒线性化和毕赤酵母的转化 | 第139页 |
| 5.2.5.5 产脂肪酶重组子的筛选 | 第139页 |
| 5.2.5.6 突变脂肪酶的纯化 | 第139-140页 |
| 5.2.5.7 突变脂肪酶性质分析 | 第140页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第140-147页 |
| 5.3.1 脂肪酶基因的定点突变 | 第140-142页 |
| 5.3.2 突变脂肪酶的分子量分析 | 第142-143页 |
| 5.3.3 N-糖基化对脂肪酶分泌的影响 | 第143-144页 |
| 5.3.4 突变脂肪酶的温度稳定性分析 | 第144-146页 |
| 5.3.5 酶动力学参数的分析 | 第146-147页 |
| 5.4 小结 | 第147-148页 |
| 参考文献 | 第148-150页 |
| 第六章 结论 | 第150-153页 |
| 本论文创新点 | 第153-154页 |
| 问题与建议 | 第154-155页 |
| 附录 | 第155-163页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第163-164页 |
| 致谢 | 第164-165页 |
| 作者和导师简介 | 第165页 |
