| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 目录 | 第8-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-21页 |
| 1 纤维素 | 第12-13页 |
| 1.1 纤维素的结构 | 第12-13页 |
| 2 纤维素酶 | 第13-16页 |
| 2.1 纤维素酶的分类 | 第13页 |
| 2.2 纤维素酶的结构 | 第13-14页 |
| 2.3 纤维素酶的来源 | 第14-16页 |
| 3 动物内源性纤维素酶的异源重组表达研究现状 | 第16-17页 |
| 4 福寿螺内源性纤维素酶EG27 | 第17页 |
| 5 毕赤酵母表达系统 | 第17-20页 |
| 5.1 毕赤酵母表达系统常用的启动子 | 第18-19页 |
| 5.2 基因拷贝数对外源蛋白表达水平的影响 | 第19页 |
| 5.3 信号肽与外源蛋白的分泌 | 第19-20页 |
| 6 研究的目的和意义 | 第20-21页 |
| 第二章 利用pGAPZαA载体构建EG27的毕赤酵母重组表达菌及利用响应面法优化培养条件 | 第21-36页 |
| 1 引言 | 第21页 |
| 2 实验材料 | 第21-23页 |
| 2.1 实验菌株与载体 | 第21-22页 |
| 2.2 实验试剂 | 第22页 |
| 2.3 仪器设备 | 第22页 |
| 2.4 溶液的配制 | 第22-23页 |
| 3. 实验方法 | 第23-28页 |
| 3.1 目的基因的扩增 | 第23-24页 |
| 3.2 重组质粒pGAPZαA-EG27的构建 | 第24-25页 |
| 3.3 大肠杆菌感受态细胞的制备方法 | 第25页 |
| 3.4 质粒转化大肠杆菌感受态的方法 | 第25-26页 |
| 3.5 质粒电转化毕赤酵母的方法 | 第26-27页 |
| 3.6 EG27酶活力的测定 | 第27页 |
| 3.7 摇瓶培养 | 第27页 |
| 3.8 Box-Behnken组合实验与响应面分析 | 第27-28页 |
| 4 实验结果 | 第28-35页 |
| 4.1 以pPIC9K-EG27为模版的PCR结果图谱 | 第28页 |
| 4.2 重组质粒的双酶切鉴定图谱 | 第28-29页 |
| 4.3 EG27的重组毕赤酵母表达菌pGAPZaA-EG27/SMD1168的基因组PCR鉴定图谱 | 第29页 |
| 4.4 重组菌pGAPZaA-EG27/SMD1168培养条件的单因素实验 | 第29-31页 |
| 4.5 Box-Behnken组合实验与响应面分析 | 第31-35页 |
| 5 讨论 | 第35-36页 |
| 第三章 改造pGAPZaA载体并利用改造后的载体pGAPH重组表达EG27的研究 | 第36-56页 |
| 1 引言 | 第36页 |
| 2 实验材料 | 第36-38页 |
| 2.1 实验菌株与载体 | 第36页 |
| 2.2 实验试剂 | 第36-37页 |
| 2.3 仪器设备 | 第37页 |
| 2.4 溶液的配制 | 第37-38页 |
| 3 实验方法 | 第38-42页 |
| 3.1 pGAPZaA载体的改造 | 第38-39页 |
| 3.2 pGAPH-EG27重组表达质粒的构建 | 第39-41页 |
| 3.3 EG27毕赤酵母重组表达菌株pGAPH-EG27/SMD1163的构建 | 第41页 |
| 3.4 重组菌株pGAPH-EG27/SMD1163的发酵培养 | 第41页 |
| 3.5 重组蛋白的纯化 | 第41-42页 |
| 3.6 刚果红染色实验 | 第42页 |
| 3.7 最适pH、最适温度、pH稳定性、温度稳定性的测定 | 第42页 |
| 4 实验结果 | 第42-54页 |
| 4.1 pGAPH载体的双酶切及PCR鉴定 | 第42-43页 |
| 4.2 pGAPH-EG27质粒的鉴定 | 第43-44页 |
| 4.3 重组菌pGAPH-EG27/SMD1163的基因组PCR鉴定 | 第44页 |
| 4.4 重组菌pGAPH-EG27/SMD1163的发酵过程数据 | 第44-45页 |
| 4.5 发酵各时间点SDS-PAGE电泳结果 | 第45-46页 |
| 4.6 纯化过程中的柱层析图谱 | 第46-47页 |
| 4.7 纯化各步的SDS-PAGE电泳结果 | 第47-48页 |
| 4.8 纯化各步数据总结 | 第48-49页 |
| 4.9 重组EG27的时间进程曲线 | 第49页 |
| 4.10 重组EG27刚果红染色结果 | 第49页 |
| 4.11 pH和温度对酶活性的影响 | 第49-51页 |
| 4.12 重组EG27在100℃失活曲线 | 第51-52页 |
| 4.13 重组蛋白的N-端氨基酸残基序列测定 | 第52-54页 |
| 5 讨论 | 第54-56页 |
| 第四章 Western-Blot比较分析两种重组表达菌株表达EG27能力 | 第56-61页 |
| 1 引言 | 第56页 |
| 2 实验材料 | 第56-57页 |
| 2.1 实验仪器 | 第56页 |
| 2.2 实验试剂与材料 | 第56-57页 |
| 2.3 溶液配制 | 第57页 |
| 3 实验方法 | 第57-58页 |
| 3.1 样品制备 | 第57页 |
| 3.2 Western-Blot | 第57-58页 |
| 3.3 免疫小鼠 | 第58页 |
| 3.4 效价检测 | 第58页 |
| 4 实验结果 | 第58-60页 |
| 4.1 免疫血清的效价测定 | 第58-59页 |
| 4.3 Western-Blot | 第59页 |
| 4.4 灰度定量 | 第59-60页 |
| 5 讨论 | 第60-61页 |
| 第五章 结论与展望 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-68页 |
| 致谢 | 第68页 |
