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猪Rspo3基因的原核及真核表达研究

致谢第4-6页
目录第6-10页
摘要第10-12页
第一章 文献综述第12-21页
    综述一 Rspo基因研究进展第12-17页
    综述二 影响质粒载体表达效率DNA序列研究进展第17-21页
第二章 猪Rspo3基因的克隆与组织分布第21-30页
    1 引言第21页
    2 材料与方法第21-22页
        2.1 试验材料第21页
        2.2 菌株和质粒第21页
        2.3 主要仪器第21页
        2.4 主要试剂第21-22页
    3 方法第22-24页
        3.1 猪Rspo3基因的RT-PCR扩增第22-24页
            3.1.1 猪Rspo3基因引物设计与克隆第22页
            3.1.2 猪各个组织总RNA的提取第22页
            3.1.3 反转录第22页
            3.1.4 PCR扩增第22-23页
            3.1.5 PCR产物切胶纯化第23页
            3.1.6 连接T载体第23-24页
        3.2 DNA序列分析第24页
        3.3 猪Rspo3基因的组织分布第24页
    4 结果与分析第24-28页
        4.1 猪Rspo3基因的RT-PCR扩增第24-26页
        4.2 猪Rspo3克隆序列分析第26-28页
        4.3 猪Rspo3基因的组织分布第28页
    5 讨论第28-29页
    6 小结第29-30页
第三章 猪Rspo3基因的原核表达第30-41页
    1 引言第30页
    2 材料与方法第30-31页
        2.1 试验材料第30页
        2.2 菌株和质粒第30页
        2.3 主要仪器第30页
        2.4 主要试剂第30-31页
    3 方法第31-33页
        3.1 猪pET-28a(+)-Rspo3原核表达载体的构建与鉴定第31-32页
            3.1.1 表达载体的提取纯化与pET-28a(+)-Rspo3重组表达载体的构建第31-32页
            3.1.2 重组质粒的转化和筛选第32页
            3.1.3 重组质粒的菌液PCR鉴定第32页
            3.1.4 重组质粒的酶切鉴定第32页
            3.1.5 重组表达质粒的序列测定第32页
        3.2 猪Rspo3基因的原核表达第32-33页
            3.2.1 表达载体转化进宿主细胞BL21及鉴定第32页
            3.2.2 表达条件的筛选第32-33页
        3.3 猪Rspo3蛋白的Western blot鉴定第33页
    4 结果与分析第33-39页
        4.1 猪pET-28a(+)-Rspo3原核表达载体的构建与鉴定第33-36页
            4.1.1 重组表达载体的构建第33-34页
            4.1.2 重组表达载体的鉴定第34-36页
                4.1.2.1 重组质粒的菌落PCR鉴定第34-35页
                4.1.2.2 重组质粒的酶切鉴定第35页
                4.1.2.3 重组质粒的测序鉴定结果第35-36页
        4.2 猪Rspo3基因的原核表达第36-38页
            4.2.1 表达载体转化宿主细胞BL21及鉴定第36-38页
            4.2.2 表达条件的筛选第38页
        4.3 Western blot鉴定第38-39页
    5 结论与讨论第39-40页
    6 小结第40-41页
第四章 不同启动子的猪Rspo3基因的真核表达载体构建第41-53页
    1 引言第41页
    2 材料与方法第41-42页
        2.1 试验材料第41页
        2.2 菌株和质粒第41页
        2.3 主要仪器第41-42页
        2.4 主要试剂第42页
    3 方法第42-46页
        3.1 Rspo3基因的同义突变第42页
        3.2 Rspo3基因的同义突变的鉴定第42-44页
        3.3 Rspo3突变产物与T载体连接第44-45页
        3.4 10种真核表达载体(P1-P10)的提取纯化与重组表达载体的构建第45-46页
        3.5 重组质粒的转化筛选与PCR鉴定第46页
        3.6 重组质粒的Nco I/Nhe I双酶切鉴定与序列测定第46页
    4 结果与分析第46-51页
        4.1 Rspo3基因的同义突变第46-48页
        4.2 Rspo3基因的同义突变的鉴定第48页
        4.3 Rspo3突变产物与T载体连接第48-49页
        4.4 10种真核表达载体(P1-P10)的提取纯化与重组表达载体的构建第49-50页
        4.5 重组质粒的转化筛选与PCR鉴定第50页
        4.6 重组质粒的NcoI/NheI双酶切鉴定与序列测定第50-51页
    5 讨论第51-52页
    6 小结第52-53页
第五章 不同启动子组合真核表达载体在不同细胞系表达效率筛选第53-72页
    1 引言第53页
    2 材料与方法第53-54页
        2.1 试验材料第53页
        2.2 质粒和细胞第53页
        2.3 主要仪器第53页
        2.4 主要试剂第53-54页
    3 方法第54-59页
        3.1 真核表达载体在PK15细胞表达研究第54-56页
            3.1.1 真核表达载体(P1-P10)GFP表达荧光显微镜检测第54页
            3.1.2 真核表达载体(P1-P10)表达GFP荧光吸光值检测第54页
            3.1.3 真核表达载体(P1-P10)在PK15上GFP持续表达时间检测第54-55页
            3.1.4 Q-PCR检测携带Rspo3的真核表达载体在PK15中的表达第55-56页
        3.2 真核表达载体(P1-P10)在MDCK细胞GFP表达第56-57页
            3.2.1 真核表达载体(P1-P10)GFP表达荧光显微镜检测第56页
            3.2.2 真核表达载体(P1-P10)GFP表达GFP荧光吸光值检测第56页
            3.2.3 真核表达载体(P1-P10)在MDCK上GFP持续表达时间检测第56-57页
        3.3 真核表达载体(P1-P10)在Hela细胞GFP表达第57-58页
            3.3.1 真核表达载体(P1-P10)GFP表达荧光显微镜检测第57页
            3.3.2 真核表达载体(P1-P10)表达GFP荧光吸光值检测第57页
            3.3.3 真核表达载体(P1-P10)在Hela上GFP持续表达时间检测第57-58页
        3.4 真核表达载体(P1-P10)在DF1细胞GFP表达第58-59页
            3.4.1 真核表达载体(P1-P10)GFP表达荧光显微镜检测第58页
            3.4.2 真核表达载体(P1-P10)表达GFP荧光吸光值检测第58页
            3.4.3 真核表达载体(P1-P10)在DF1上GFP持续表达时间检测第58-59页
    4 结果与分析第59-70页
        4.1 真核表达载体在PK15细胞表达研究第59-62页
            4.1.1 真核表达载体(P1-P10)GFP表达荧光显微镜检测第59-60页
            4.1.2 真核表达载体(P1-P10)表达GFP荧光吸光值检测第60页
            4.1.3 真核表达载体(P1-P10)GFP在PK15上表达时间检测第60-61页
            4.1.4 Q-PCR检测携带Rspo3的真核表达载体在PK15中的表达第61-62页
        4.2 真核表达载体(P1-P10)在MDCK细胞GFP表达第62-65页
            4.2.1 真核表达载体(P1-P10)GFP表达荧光显微镜检测第62-63页
            4.2.2 真核表达载体(P1-P10)GFP表达GFP荧光吸光值检测第63-64页
            4.2.3 真核表达载体(P1-P10)在MDCK上GFP持续表达时间检测第64-65页
        4.3 真核表达载体(P1-P10)在Hela细胞GFP表达第65-68页
            4.3.1 真核表达载体(P1-P10)GFP表达荧光显微镜检测第65-66页
            4.3.2 真核表达载体(P1-P10)表达GFP荧光吸光值检测第66-67页
            4.3.3 真核表达载体(P1-P10)在Hela上GFP持续表达时间检测第67-68页
        4.4 真核表达载体(P1-P10)在DF1细胞GFP表达第68-70页
            4.4.1 真核表达载体(P1-P10)GFP表达荧光显微镜检测第68页
            4.4.2 真核表达载体(P1-P10)表达GFP荧光吸光值检测第68-69页
            4.4.3 真核表达载体(P1-P10)在DF1上GFP持续表达时间检测第69-70页
    5 结论与讨论第70-71页
        5.1 PK15细胞上不同启动子组合的质粒表达第70-71页
        5.2 MDCK、Hela和DF1细胞上不同启动子组合的质粒表达第71页
    6 小结第71-72页
本文创新点第72-73页
Abstract第73-74页
参考文献第75-84页
附录一:作者简介及发表的文章第84-85页
附录二:缩略词表第85页

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