| 致谢 | 第4-6页 |
| 目录 | 第6-10页 |
| 摘要 | 第10-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-21页 |
| 综述一 Rspo基因研究进展 | 第12-17页 |
| 综述二 影响质粒载体表达效率DNA序列研究进展 | 第17-21页 |
| 第二章 猪Rspo3基因的克隆与组织分布 | 第21-30页 |
| 1 引言 | 第21页 |
| 2 材料与方法 | 第21-22页 |
| 2.1 试验材料 | 第21页 |
| 2.2 菌株和质粒 | 第21页 |
| 2.3 主要仪器 | 第21页 |
| 2.4 主要试剂 | 第21-22页 |
| 3 方法 | 第22-24页 |
| 3.1 猪Rspo3基因的RT-PCR扩增 | 第22-24页 |
| 3.1.1 猪Rspo3基因引物设计与克隆 | 第22页 |
| 3.1.2 猪各个组织总RNA的提取 | 第22页 |
| 3.1.3 反转录 | 第22页 |
| 3.1.4 PCR扩增 | 第22-23页 |
| 3.1.5 PCR产物切胶纯化 | 第23页 |
| 3.1.6 连接T载体 | 第23-24页 |
| 3.2 DNA序列分析 | 第24页 |
| 3.3 猪Rspo3基因的组织分布 | 第24页 |
| 4 结果与分析 | 第24-28页 |
| 4.1 猪Rspo3基因的RT-PCR扩增 | 第24-26页 |
| 4.2 猪Rspo3克隆序列分析 | 第26-28页 |
| 4.3 猪Rspo3基因的组织分布 | 第28页 |
| 5 讨论 | 第28-29页 |
| 6 小结 | 第29-30页 |
| 第三章 猪Rspo3基因的原核表达 | 第30-41页 |
| 1 引言 | 第30页 |
| 2 材料与方法 | 第30-31页 |
| 2.1 试验材料 | 第30页 |
| 2.2 菌株和质粒 | 第30页 |
| 2.3 主要仪器 | 第30页 |
| 2.4 主要试剂 | 第30-31页 |
| 3 方法 | 第31-33页 |
| 3.1 猪pET-28a(+)-Rspo3原核表达载体的构建与鉴定 | 第31-32页 |
| 3.1.1 表达载体的提取纯化与pET-28a(+)-Rspo3重组表达载体的构建 | 第31-32页 |
| 3.1.2 重组质粒的转化和筛选 | 第32页 |
| 3.1.3 重组质粒的菌液PCR鉴定 | 第32页 |
| 3.1.4 重组质粒的酶切鉴定 | 第32页 |
| 3.1.5 重组表达质粒的序列测定 | 第32页 |
| 3.2 猪Rspo3基因的原核表达 | 第32-33页 |
| 3.2.1 表达载体转化进宿主细胞BL21及鉴定 | 第32页 |
| 3.2.2 表达条件的筛选 | 第32-33页 |
| 3.3 猪Rspo3蛋白的Western blot鉴定 | 第33页 |
| 4 结果与分析 | 第33-39页 |
| 4.1 猪pET-28a(+)-Rspo3原核表达载体的构建与鉴定 | 第33-36页 |
| 4.1.1 重组表达载体的构建 | 第33-34页 |
| 4.1.2 重组表达载体的鉴定 | 第34-36页 |
| 4.1.2.1 重组质粒的菌落PCR鉴定 | 第34-35页 |
| 4.1.2.2 重组质粒的酶切鉴定 | 第35页 |
| 4.1.2.3 重组质粒的测序鉴定结果 | 第35-36页 |
| 4.2 猪Rspo3基因的原核表达 | 第36-38页 |
| 4.2.1 表达载体转化宿主细胞BL21及鉴定 | 第36-38页 |
| 4.2.2 表达条件的筛选 | 第38页 |
| 4.3 Western blot鉴定 | 第38-39页 |
| 5 结论与讨论 | 第39-40页 |
| 6 小结 | 第40-41页 |
| 第四章 不同启动子的猪Rspo3基因的真核表达载体构建 | 第41-53页 |
| 1 引言 | 第41页 |
| 2 材料与方法 | 第41-42页 |
| 2.1 试验材料 | 第41页 |
| 2.2 菌株和质粒 | 第41页 |
| 2.3 主要仪器 | 第41-42页 |
| 2.4 主要试剂 | 第42页 |
| 3 方法 | 第42-46页 |
| 3.1 Rspo3基因的同义突变 | 第42页 |
| 3.2 Rspo3基因的同义突变的鉴定 | 第42-44页 |
| 3.3 Rspo3突变产物与T载体连接 | 第44-45页 |
| 3.4 10种真核表达载体(P1-P10)的提取纯化与重组表达载体的构建 | 第45-46页 |
| 3.5 重组质粒的转化筛选与PCR鉴定 | 第46页 |
| 3.6 重组质粒的Nco I/Nhe I双酶切鉴定与序列测定 | 第46页 |
| 4 结果与分析 | 第46-51页 |
| 4.1 Rspo3基因的同义突变 | 第46-48页 |
| 4.2 Rspo3基因的同义突变的鉴定 | 第48页 |
| 4.3 Rspo3突变产物与T载体连接 | 第48-49页 |
| 4.4 10种真核表达载体(P1-P10)的提取纯化与重组表达载体的构建 | 第49-50页 |
| 4.5 重组质粒的转化筛选与PCR鉴定 | 第50页 |
| 4.6 重组质粒的NcoI/NheI双酶切鉴定与序列测定 | 第50-51页 |
| 5 讨论 | 第51-52页 |
| 6 小结 | 第52-53页 |
| 第五章 不同启动子组合真核表达载体在不同细胞系表达效率筛选 | 第53-72页 |
| 1 引言 | 第53页 |
| 2 材料与方法 | 第53-54页 |
| 2.1 试验材料 | 第53页 |
| 2.2 质粒和细胞 | 第53页 |
| 2.3 主要仪器 | 第53页 |
| 2.4 主要试剂 | 第53-54页 |
| 3 方法 | 第54-59页 |
| 3.1 真核表达载体在PK15细胞表达研究 | 第54-56页 |
| 3.1.1 真核表达载体(P1-P10)GFP表达荧光显微镜检测 | 第54页 |
| 3.1.2 真核表达载体(P1-P10)表达GFP荧光吸光值检测 | 第54页 |
| 3.1.3 真核表达载体(P1-P10)在PK15上GFP持续表达时间检测 | 第54-55页 |
| 3.1.4 Q-PCR检测携带Rspo3的真核表达载体在PK15中的表达 | 第55-56页 |
| 3.2 真核表达载体(P1-P10)在MDCK细胞GFP表达 | 第56-57页 |
| 3.2.1 真核表达载体(P1-P10)GFP表达荧光显微镜检测 | 第56页 |
| 3.2.2 真核表达载体(P1-P10)GFP表达GFP荧光吸光值检测 | 第56页 |
| 3.2.3 真核表达载体(P1-P10)在MDCK上GFP持续表达时间检测 | 第56-57页 |
| 3.3 真核表达载体(P1-P10)在Hela细胞GFP表达 | 第57-58页 |
| 3.3.1 真核表达载体(P1-P10)GFP表达荧光显微镜检测 | 第57页 |
| 3.3.2 真核表达载体(P1-P10)表达GFP荧光吸光值检测 | 第57页 |
| 3.3.3 真核表达载体(P1-P10)在Hela上GFP持续表达时间检测 | 第57-58页 |
| 3.4 真核表达载体(P1-P10)在DF1细胞GFP表达 | 第58-59页 |
| 3.4.1 真核表达载体(P1-P10)GFP表达荧光显微镜检测 | 第58页 |
| 3.4.2 真核表达载体(P1-P10)表达GFP荧光吸光值检测 | 第58页 |
| 3.4.3 真核表达载体(P1-P10)在DF1上GFP持续表达时间检测 | 第58-59页 |
| 4 结果与分析 | 第59-70页 |
| 4.1 真核表达载体在PK15细胞表达研究 | 第59-62页 |
| 4.1.1 真核表达载体(P1-P10)GFP表达荧光显微镜检测 | 第59-60页 |
| 4.1.2 真核表达载体(P1-P10)表达GFP荧光吸光值检测 | 第60页 |
| 4.1.3 真核表达载体(P1-P10)GFP在PK15上表达时间检测 | 第60-61页 |
| 4.1.4 Q-PCR检测携带Rspo3的真核表达载体在PK15中的表达 | 第61-62页 |
| 4.2 真核表达载体(P1-P10)在MDCK细胞GFP表达 | 第62-65页 |
| 4.2.1 真核表达载体(P1-P10)GFP表达荧光显微镜检测 | 第62-63页 |
| 4.2.2 真核表达载体(P1-P10)GFP表达GFP荧光吸光值检测 | 第63-64页 |
| 4.2.3 真核表达载体(P1-P10)在MDCK上GFP持续表达时间检测 | 第64-65页 |
| 4.3 真核表达载体(P1-P10)在Hela细胞GFP表达 | 第65-68页 |
| 4.3.1 真核表达载体(P1-P10)GFP表达荧光显微镜检测 | 第65-66页 |
| 4.3.2 真核表达载体(P1-P10)表达GFP荧光吸光值检测 | 第66-67页 |
| 4.3.3 真核表达载体(P1-P10)在Hela上GFP持续表达时间检测 | 第67-68页 |
| 4.4 真核表达载体(P1-P10)在DF1细胞GFP表达 | 第68-70页 |
| 4.4.1 真核表达载体(P1-P10)GFP表达荧光显微镜检测 | 第68页 |
| 4.4.2 真核表达载体(P1-P10)表达GFP荧光吸光值检测 | 第68-69页 |
| 4.4.3 真核表达载体(P1-P10)在DF1上GFP持续表达时间检测 | 第69-70页 |
| 5 结论与讨论 | 第70-71页 |
| 5.1 PK15细胞上不同启动子组合的质粒表达 | 第70-71页 |
| 5.2 MDCK、Hela和DF1细胞上不同启动子组合的质粒表达 | 第71页 |
| 6 小结 | 第71-72页 |
| 本文创新点 | 第72-73页 |
| Abstract | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第75-84页 |
| 附录一：作者简介及发表的文章 | 第84-85页 |
| 附录二：缩略词表 | 第85页 |
