| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 缩略表 | 第8-9页 |
| 目录 | 第9-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-18页 |
| 1 红细胞分化 | 第12-13页 |
| 2 RbAp48蛋白的研究现状 | 第13-15页 |
| 3 PBDC1蛋白简介 | 第15页 |
| 4 大肠杆菌表达系统 | 第15-16页 |
| 5 研究目的及意义 | 第16-17页 |
| 6 技术路线和方法 | 第17-18页 |
| 第二章 RbAp48在丁酸钠诱导MEL细胞分化中的功能研究 | 第18-46页 |
| 1 前言 | 第18页 |
| 2 材料与方法 | 第18-34页 |
| 2.1 材料 | 第18-22页 |
| 2.1.1 细胞、菌株和质粒 | 第18页 |
| 2.1.2 仪器 | 第18-19页 |
| 2.1.3 试剂 | 第19-20页 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 | 第20-22页 |
| 2.2 方法 | 第22-34页 |
| 2.2.1 细胞培养 | 第22页 |
| 2.2.2 联苯胺染色检测丁酸钠诱导MEL细胞向红系方向分化 | 第22页 |
| 2.2.3 MTT比色法检测丁酸钠对MEL细胞活力的影响 | 第22页 |
| 2.2.4 半定量PCR法检测红系相关基因在MEL细胞分化中的表达情况 | 第22-25页 |
| 2.2.4.1 半定量PCR引物设计 | 第22-23页 |
| 2.2.4.2 细胞总RNA的提取 | 第23页 |
| 2.2.4.3 RNA的反转录 | 第23-24页 |
| 2.2.4.4 半定量PCR检测红系相关基因的表达情况 | 第24-25页 |
| 2.2.5 瑞氏染色 | 第25页 |
| 2.2.6 Western blot检测RbAp48在MEL细胞分化中的表达变化 | 第25-26页 |
| 2.2.7 Western blot检测GATA-1和c-Myc在MEL细胞分化中的表达变化 | 第26页 |
| 2.2.8 Western blot检测RbAp48在小鼠胎肝发育过程中的表达情况 | 第26页 |
| 2.2.9 Western blot分析RbAp48的小鼠组织表达谱 | 第26页 |
| 2.2.10 免疫荧光实验检测RbAp48在MEL细胞分化过程中的细胞定位 | 第26-27页 |
| 2.2.11 干扰载体pLKO.1-RbAp48-shRNA的构建 | 第27-32页 |
| 2.2.11.1 pLKO.1-TRC载体的实验室应用 | 第27-28页 |
| 2.2.11.2 shRNA寡核苷酸序列的设计 | 第28页 |
| 2.2.11.3 寡核苷酸片段的退火 | 第28页 |
| 2.2.11.4 pLKO.1-TRC质粒的小量提取 | 第28-29页 |
| 2.2.11.5 pLKO.1-TRC质粒的双酶切 | 第29-30页 |
| 2.2.11.6 pLKO.1-TRC与退火的寡核苷酸片段连接 | 第30页 |
| 2.2.11.7 E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第30页 |
| 2.2.11.8 连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞 | 第30-31页 |
| 2.2.11.9 干扰载体pLKO.1-RbAp48-shRNA的双酶切鉴定 | 第31页 |
| 2.2.11.10 测序鉴定 | 第31-32页 |
| 2.2.12 慢病毒的包装 | 第32-33页 |
| 2.2.12.1 质粒的大抽 | 第32页 |
| 2.2.12.2 病毒包装 | 第32-33页 |
| 2.2.13 低表达RbAp48的MEL细胞稳定株的建立 | 第33页 |
| 2.2.14 Western blot检证低表达RbAp48的MEL细胞稳定株 | 第33页 |
| 2.2.15 低表达RbAp48对丁酸钠诱导MEL细胞红系分化能力的影响 | 第33-34页 |
| 3 结果 | 第34-43页 |
| 3.1 丁酸钠诱导MEL细胞向红系方向分化 | 第34-36页 |
| 3.1.1 联苯胺染色检测血红蛋白的表达 | 第34页 |
| 3.1.2 联苯胺阳性细胞的统计 | 第34-35页 |
| 3.1.3 丁酸钠抑制了MEL细胞生长活力 | 第35页 |
| 3.1.4 α-globin,β-globin,and GPA mRNA在MEL细胞分化过程中逐渐上调 | 第35-36页 |
| 3.2 瑞氏染色检测表明MEL细胞分化后出现核固缩 | 第36页 |
| 3.3 RbAp48在MEL细胞分化过程中逐渐上调 | 第36-37页 |
| 3.4 c-Myc在MEL细胞分化过程中逐渐下调,GATA-1在分化早期上调 | 第37页 |
| 3.5 RbAp48在小鼠胎肝发育过程中逐渐上调 | 第37-38页 |
| 3.6 RbAp48在小鼠不同组织中广泛表达 | 第38页 |
| 3.7 RbAp48在MEL分化过程中的亚细胞定位 | 第38-39页 |
| 3.8 干扰载体pLKO.1-RbAp48-shRNA的鉴定 | 第39-40页 |
| 3.8.1 干扰载体pLKO.1-RbAp48-shRNA的双酶切鉴定 | 第39-40页 |
| 3.8.2 干扰载体pLKO.1-RbAp48-shRNA的测序鉴定 | 第40页 |
| 3.9 病毒包装时转染效率的检测 | 第40-41页 |
| 3.10 低表达RbAp48的MEL细胞稳定株的筛选 | 第41页 |
| 3.11 Western blot鉴定低表达RbAp48的MEL细胞稳定株 | 第41-42页 |
| 3.12 低表达RbAp48抑制了丁酸钠诱导MEL细胞的红系分化能力 | 第42-43页 |
| 4 讨论 | 第43-46页 |
| 第三章 PBDC1在丁酸钠诱导MEL细胞分化中的功能研究 | 第46-63页 |
| 1 前言 | 第46页 |
| 2 材料与方法 | 第46-56页 |
| 2.1 材料 | 第46-48页 |
| 2.1.1 细胞株、菌株及质粒 | 第46页 |
| 2.1.2 仪器 | 第46-47页 |
| 2.1.3 试剂 | 第47页 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 | 第47-48页 |
| 2.2 方法 | 第48-56页 |
| 2.2.1 重组pET-28a(+)-PBDC1质粒的构建 | 第48-51页 |
| 2.2.1.1 pET-28a(+)载体的实验室应用 | 第48-49页 |
| 2.2.1.2 MEL细胞中总RNA的提取 | 第49页 |
| 2.2.1.3 RNA的反转录 | 第49页 |
| 2.2.1.4 PBDC1基因的引物设计 | 第49-50页 |
| 2.2.1.5 PBDC1基因的克隆 | 第50页 |
| 2.2.1.6 pET-28(+)质粒的提取 | 第50页 |
| 2.2.1.7 PBDC1基因与pET-28a(+)质粒连接 | 第50-51页 |
| 2.2.1.8 E.coli BL21(DE3)感受态细胞的制备 | 第51页 |
| 2.2.1.9 连接产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞 | 第51页 |
| 2.2.2 重组pET-28a(+)-PBDC1质粒的鉴定 | 第51-53页 |
| 2.2.2.1 重组pET-28a(+)-PBDC1质粒的PCR鉴定 | 第51-52页 |
| 2.2.2.2 重组pET-28a(+)-PBDC1质粒的双酶切鉴定 | 第52-53页 |
| 2.2.2.3 重组pET-28a(+)-PBDC1质粒的测序鉴定 | 第53页 |
| 2.2.3 PBDC1蛋白的表达、纯化及鉴定 | 第53-54页 |
| 2.2.3.1 PBDC1蛋白的表达 | 第53页 |
| 2.2.3.2 PBDC1蛋白的纯化 | 第53-54页 |
| 2.2.3.3 PBDC1蛋白的质谱鉴定 | 第54页 |
| 2.2.4 PBDC1多克隆抗体的制备、纯化及鉴定 | 第54-55页 |
| 2.2.4.1 PBDC1多克隆抗体的制备 | 第54页 |
| 2.2.4.2 PBDC1多克隆抗体的纯化 | 第54页 |
| 2.2.4.3 PBDC1多克隆抗体的ELISA检测 | 第54-55页 |
| 2.2.4.4 PBDC1多克隆抗体的Western blot检测 | 第55页 |
| 2.2.5 Western blot检测PBDC1在MEL细胞分化中的表达变化 | 第55页 |
| 2.2.6 Real-time PCR检测PBDC1在MEL细胞分化中的表达变化 | 第55-56页 |
| 2.2.6.1 荧光定量PCR引物的设计 | 第55页 |
| 2.2.6.2 细胞总RNA的提取 | 第55页 |
| 2.2.6.3 RNA反转录 | 第55页 |
| 2.2.6.4 实时定量PCR | 第55-56页 |
| 3 结果 | 第56-62页 |
| 3.1 PCR扩增PBDC1基因 | 第56-57页 |
| 3.2 重组质粒pET-28a(+)-PBDCl的鉴定 | 第57-58页 |
| 3.2.1 重组质粒pET-28a(+)-PBDC1的PCR鉴定和双酶切鉴定 | 第57页 |
| 3.2.2 重组质粒pET-28a(+)-PBDC1的测序鉴定 | 第57-58页 |
| 3.3 PBDC1蛋白的表达及可溶性分析 | 第58-59页 |
| 3.4 PBDC1蛋白的纯化及鉴定 | 第59页 |
| 3.5 PBDC1多克隆抗体的ELISA检测 | 第59-60页 |
| 3.6 PBDC1多克隆抗体的Western blot检测 | 第60页 |
| 3.7 PBDC1在丁酸钠诱导MEL细胞分化中逐渐下调 | 第60页 |
| 3.8 PBDC1 mRNA在丁酸钠诱导MEL细胞分化中逐渐下调 | 第60-62页 |
| 4 讨论 | 第62-63页 |
| 第四章 结论和展望 | 第63-65页 |
| 1 结论 | 第63-64页 |
| 1.1 RbAp48在丁酸钠诱导MEL细胞分化中的功能研究 | 第63页 |
| 1.2 PBDC1在丁酸钠诱导MEL细胞分化中的功能研究 | 第63-64页 |
| 2 展望 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-68页 |
| 致谢 | 第68-69页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第69页 |
