| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 前言 | 第11-17页 |
| 1.1 暗黑鳃金龟简介 | 第11页 |
| 1.2 几丁质酶 | 第11-13页 |
| 1.2.1 昆虫几丁质酶及其基本结构 | 第11-12页 |
| 1.2.2 昆虫几丁质酶分类 | 第12-13页 |
| 1.3 昆虫几丁质酶基因的筛选 | 第13-14页 |
| 1.4 昆虫几丁质酶在生物防治中的应用 | 第14-15页 |
| 1.5 昆虫杆状病毒表达系统 | 第15-16页 |
| 1.5.1 昆虫杆状病毒表达系统简介 | 第15页 |
| 1.5.2 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统 | 第15-16页 |
| 1.6 实验目的及意义 | 第16-17页 |
| 第二章 暗黑鳃金龟几丁质酶基因的分离鉴定 | 第17-27页 |
| 2.1 实验材料 | 第17-19页 |
| 2.1.1 文库、抗体 | 第17页 |
| 2.1.2 宿主菌、试剂盒和主要工具酶 | 第17页 |
| 2.1.3 主要试剂及溶液 | 第17-19页 |
| 2.2 实验方法 | 第19-21页 |
| 2.2.1 大肠杆菌XL1-Blue的感受态细胞制备 | 第19页 |
| 2.2.2 暗黑鳃金龟中肠cDNA表达文库的免疫筛选 | 第19页 |
| 2.2.3 阳性克隆的鉴定 | 第19-21页 |
| 2.2.4 暗黑鳃金龟几丁质酶基因HpChi的生物信息学分析 | 第21页 |
| 2.3 结果与分析 | 第21-26页 |
| 2.3.1 暗黑鳃金龟几丁质酶基因的筛选 | 第21页 |
| 2.3.2 阳性克隆的鉴定 | 第21-22页 |
| 2.3.3 核苷酸和氨基酸的一级序列分析 | 第22-24页 |
| 2.3.4 HpChi蛋白的二、三级结构预测 | 第24-25页 |
| 2.3.5 暗黑鳃金龟幼虫几丁质酶HpChi的聚类分析 | 第25-26页 |
| 2.4 小结 | 第26-27页 |
| 第三章 暗黑鳃金龟几丁质酶hpChi的原核表达分析 | 第27-33页 |
| 3.1 实验材料 | 第27页 |
| 3.2 实验方法 | 第27-31页 |
| 3.2.1 hpChi目的基因的获取 | 第27页 |
| 3.2.2 hpChi的回收纯化 | 第27-28页 |
| 3.2.3 hpChi与载体DNA的相应酶切、纯化 | 第28页 |
| 3.2.4 hpChi及载体DNA的连接 | 第28页 |
| 3.2.5 氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞 | 第28页 |
| 3.2.6 pET30a-hpChi的转化与鉴定 | 第28-29页 |
| 3.2.7 重组质粒的筛选与鉴定 | 第29页 |
| 3.2.8 融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测 | 第29页 |
| 3.2.9 融合蛋白的Western blot鉴定 | 第29-30页 |
| 3.2.10 几丁质酶HpChi的纯化 | 第30页 |
| 3.2.11 制备多克隆抗体 | 第30-31页 |
| 3.3 结果与分析 | 第31-32页 |
| 3.3.1 pET30a-hpChi重组表达载体的鉴定 | 第31页 |
| 3.3.2 hpChi在E.coli BL21中的表达 | 第31-32页 |
| 3.3.3 融合蛋白的纯化 | 第32页 |
| 3.3.4 制备多克隆抗体 | 第32页 |
| 3.4 小结 | 第32-33页 |
| 第四章 暗黑鳃金龟几丁质酶基因hpChi的酵母表达 | 第33-40页 |
| 4.1 实验材料 | 第33页 |
| 4.2 实验方法 | 第33-37页 |
| 4.2.1 hpChi目的基因的获取 | 第33页 |
| 4.2.2 CTAB法提取质粒DNA | 第33-34页 |
| 4.2.3 hpChi和pPICK9K的相应酶切、纯化 | 第34页 |
| 4.2.4 hpChi和pPICK9K的连接 | 第34页 |
| 4.2.5 pPICK9K-hpChi的转化与鉴定 | 第34页 |
| 4.2.6 重组质粒pPIC9K-hpChi的线性化 | 第34-35页 |
| 4.2.7 缺陷型毕赤酵母菌株GS115的筛选 | 第35页 |
| 4.2.8 毕赤酵母GS115电激感受态细胞的制备 | 第35页 |
| 4.2.9 重组质粒pPIC9K-hpChi电激转化GS115感受态细胞 | 第35-36页 |
| 4.2.10 重组酵母菌株的初步筛选 | 第36页 |
| 4.2.11 重组酵母菌株的抗性筛选 | 第36页 |
| 4.2.12 重组酵母菌株的表型鉴定 | 第36页 |
| 4.2.13 重组酵母菌株基因组DNA的提取与PCR鉴定 | 第36-37页 |
| 4.2.14 重组酵母菌株的诱导表达 | 第37页 |
| 4.2.15 目的蛋白表达的检测 | 第37页 |
| 4.3 结果与分析 | 第37-39页 |
| 4.3.1 重组质粒pPICK9K-hpChi的鉴定 | 第37-38页 |
| 4.3.2 重组毕赤酵母菌株的表型鉴定 | 第38页 |
| 4.3.3 重组毕赤酵母菌株的PCR鉴定 | 第38-39页 |
| 4.3.4 pPIC9K-hpChi的表达检测 | 第39页 |
| 4.4 小结 | 第39-40页 |
| 第五章 暗黑鳃金龟几丁质酶hpChi的昆虫细胞表达 | 第40-46页 |
| 5.1 实验材料 | 第40页 |
| 5.1.1 昆虫细胞系 | 第40页 |
| 5.1.2 菌株和质粒 | 第40页 |
| 5.1.3 培养基与实验试剂 | 第40页 |
| 5.2 实验方法 | 第40-43页 |
| 5.2.1 hpChi目的基因的获取 | 第40页 |
| 5.2.2 pFast-hpChi重组转座载体的构建 | 第40-41页 |
| 5.2.3 Bacmid-hpChi的构建 | 第41页 |
| 5.2.4 重组Bacmid的鉴定 | 第41-42页 |
| 5.2.5 昆虫细胞的培养 | 第42页 |
| 5.2.6 重组Bacmid DNA转染昆虫细胞 | 第42-43页 |
| 5.2.7 杆状病毒的扩增 | 第43页 |
| 5.2.8 重组蛋白Western blot分析 | 第43页 |
| 5.2.9 HpChi几丁质酶活性检测 | 第43页 |
| 5.3 结果与分析 | 第43-45页 |
| 5.3.1 Bacmid-hpChi重组载体的鉴定 | 第43-44页 |
| 5.3.2 HpChi在昆虫细胞中的表达 | 第44页 |
| 5.3.3 几丁质酶的活性分析 | 第44-45页 |
| 5.4 小结 | 第45-46页 |
| 讨论 | 第46-47页 |
| 结论 | 第47-48页 |
| 参考文献 | 第48-54页 |
| 缩略词 | 第54-56页 |
| 硕士期间发表的论文 | 第56-57页 |
| 作者简介 | 第57-58页 |
| 致谢 | 第58页 |
