| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 英文缩写表 | 第10-11页 |
| 1 综述 | 第11-18页 |
| 引言 | 第11页 |
| ·植物病原菌 | 第11-14页 |
| ·植物病原菌的Ⅲ型分泌系统 | 第11-12页 |
| ·Hrp 基因簇 | 第12-13页 |
| ·Hrp 极毛与HrpA 蛋白 | 第13-14页 |
| ·Hrp 基因的诱导表达和调控 | 第14页 |
| ·植物的抗病性 | 第14-15页 |
| ·病原菌的无毒基因 | 第14-15页 |
| ·植物的抗病基因 | 第15页 |
| ·基因工程抗体技术 | 第15-17页 |
| ·单链抗体 | 第15-16页 |
| ·噬菌体展示技术 | 第16页 |
| ·植物抗体工程 | 第16-17页 |
| ·本研究目的意义 | 第17-18页 |
| 2 丁香假单胞菌极毛蛋白HrpA 的克隆表达与鉴定 | 第18-39页 |
| 引言 | 第18页 |
| ·实验材料 | 第18-20页 |
| ·菌株与载体 | 第18-19页 |
| ·主要试剂 | 第19页 |
| ·主要仪器 | 第19-20页 |
| ·培养基 | 第20页 |
| ·实验方法 | 第20-29页 |
| ·引物设计与合成 | 第20-21页 |
| ·P. syringae pv. tomato DC3000 基因组的提取 | 第21-22页 |
| ·PCR 扩增HrpA 基因 | 第22页 |
| ·表达载体pET32a(+)-HrpA 的构建 | 第22-24页 |
| ·pET32a(+)质粒的提取 | 第22-23页 |
| ·目的基因与质粒的酶切 | 第23-24页 |
| ·目的片段与载体的连接 | 第24页 |
| ·E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第24-25页 |
| ·转化实验 | 第25页 |
| ·重组质粒的筛选与验证 | 第25页 |
| ·菌株的测序 | 第25-26页 |
| ·融合蛋白的诱导表达 | 第26-27页 |
| ·质粒提取与表达宿主E.coli BL21 的转化 | 第26页 |
| ·IPTG 诱导表达 | 第26页 |
| ·SDS-PAGE 分析 | 第26-27页 |
| ·融合蛋白的大量纯化 | 第27-28页 |
| ·表达载体pET28a(+)-HrpA 的构建以及目的蛋白的诱导纯化 | 第28页 |
| ·蛋白质的浓度测定 | 第28-29页 |
| ·结果与分析 | 第29-37页 |
| ·P. syringae pv. tomato DC3000 基因组的提取 | 第29页 |
| ·PCR 扩增目的基因 | 第29-30页 |
| ·表达载体pET32a(+)-HrpA 的构建 | 第30-32页 |
| ·表达载体pET28a(+)-HrpA 的构建 | 第32-33页 |
| ·测序结果 | 第33-34页 |
| ·融合蛋白的表达和纯化 | 第34-35页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第35-37页 |
| ·讨论 | 第37-38页 |
| ·关于HrpA 基因的引物设计 | 第37页 |
| ·表达载体pET32a(+)-HrpA 的构建过程 | 第37页 |
| ·融合蛋白诱导表达与纯化 | 第37-38页 |
| ·结论 | 第38-39页 |
| 3 单链抗体的制备 | 第39-69页 |
| 引言 | 第39-40页 |
| ·实验材料 | 第40-42页 |
| ·菌株与载体 | 第40页 |
| ·主要试剂 | 第40页 |
| ·主要仪器材料 | 第40-41页 |
| ·抗体可变区的通用引物 | 第41-42页 |
| ·培养基 | 第42页 |
| ·实验方法 | 第42-56页 |
| ·小鼠的免疫 | 第42-43页 |
| ·血清效价的测定 | 第43-44页 |
| ·脾脏总RNA 的提取 | 第44页 |
| ·cDNA 的反转录合成（RT-PCR） | 第44-45页 |
| ·重链基因可变区（VH）的扩增 | 第45页 |
| ·轻链基因可变区（VL）的扩增 | 第45-46页 |
| ·scFv 的组装与扩增 | 第46-47页 |
| ·基因（scFv）与载体（pCANTAB 5E）的酶切 | 第47-48页 |
| ·基因（scFv）与载体（pCANTAB 5E）的连接 | 第48页 |
| ·单链抗体原始库菌株的建立 | 第48-50页 |
| ·E.coli TG1 电转感受态细胞的制备 | 第48-49页 |
| ·电击转化 | 第49-50页 |
| ·噬菌体抗体初级库的制备 | 第50页 |
| ·抗体初级库的库容量测定 | 第50-51页 |
| ·噬菌体抗体库的富集淘选 | 第51-52页 |
| ·特异性的单链抗体的获得 | 第52-53页 |
| ·噬菌体抗体准备阶段 | 第52页 |
| ·ELISA 方法的检测阶段 | 第52-53页 |
| ·阳性克隆的酶切与PCR 验证 | 第53页 |
| ·阳性克隆的ELISA 检测 | 第53页 |
| ·菌株的测序 | 第53-54页 |
| ·单链抗体的可溶性表达 | 第54-55页 |
| ·宿主菌E.coli HB2151 的侵染阶段 | 第54页 |
| ·抗体的可溶性表达阶段 | 第54-55页 |
| ·抗体特异性与活性检测 | 第55-56页 |
| ·ELISA 方法的检测抗体特异性 | 第55页 |
| ·Far western blot 检测抗体活性 | 第55-56页 |
| ·结果与分析 | 第56-66页 |
| ·血清效价的测定 | 第56-57页 |
| ·脾脏总RNA 的提取 | 第57页 |
| ·重链基因可变区（VH）的扩增 | 第57-58页 |
| ·轻链基因可变区（VL）的扩增 | 第58页 |
| ·scFv 的组装与扩增 | 第58-59页 |
| ·单链抗体原始库菌株的建立 | 第59页 |
| ·噬菌体单链抗体库富集淘选 | 第59-60页 |
| ·特异性的单链抗体的获得 | 第60-61页 |
| ·scFv 的PCR 和酶切验证 | 第61-62页 |
| ·scFv 的ELISA 检测 | 第62-63页 |
| ·scFv 的测序结果与分析 | 第63页 |
| ·scFv 的可溶性表达 | 第63-64页 |
| ·ELISA 方法检测抗体特异性 | 第64-65页 |
| ·Far western blot 检测抗体活性 | 第65-66页 |
| ·讨论 | 第66-68页 |
| ·BalB/C 小鼠的免疫 | 第66页 |
| ·脾脏总RNA 的提取 | 第66页 |
| ·scFv 的组装与扩增 | 第66-67页 |
| ·电击转化法 | 第67页 |
| ·噬菌体抗体库富集淘选过程 | 第67页 |
| ·特异性的单链抗体的获得 | 第67页 |
| ·Far western blot 检测抗体活性 | 第67-68页 |
| ·结论 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-75页 |
| 附录 | 第75-78页 |
| 致谢 | 第78页 |
