| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第11-21页 |
| 1.1 普鲁兰酶概述 | 第11-15页 |
| 1.1.1 普鲁兰酶的功能与应用 | 第11页 |
| 1.1.2 普鲁兰酶的结构与催化机制 | 第11-15页 |
| 1.2 大肠杆菌可溶性表达重组蛋白进展 | 第15-17页 |
| 1.3 计算机辅助提高蛋白质热稳定性 | 第17-19页 |
| 1.4 本课题的立题依据与研究内容 | 第19-21页 |
| 1.4.1 立项依据与研究意义 | 第19-20页 |
| 1.4.2 主要研究内容 | 第20-21页 |
| 第二章 细胞和发酵水平提高B. acidopullulyticus普鲁兰酶在E. coli中的可溶性表达水平 | 第21-41页 |
| 2.1 引言 | 第21页 |
| 2.2 材料与方法 | 第21-26页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第21页 |
| 2.2.2 试剂与仪器 | 第21-22页 |
| 2.2.3 培养基和培养条件 | 第22-23页 |
| 2.2.4 重组质粒的构建 | 第23-25页 |
| 2.2.5 重组质粒的转化 | 第25页 |
| 2.2.6 重组菌的筛选与鉴定 | 第25页 |
| 2.2.7 分析方法 | 第25-26页 |
| 2.2.8 透射电镜分析 | 第26页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第26-39页 |
| 2.3.1 重组菌的构建 | 第26-28页 |
| 2.3.2 pET-20b(+)-PulA表达效果检测 | 第28-29页 |
| 2.3.3 BL21(DE3)-pET-20b(+)-Pul A细胞形态分析 | 第29页 |
| 2.3.4 发酵过程参数优化提高pET-20b(+)-Pul A可溶性表达量 | 第29-33页 |
| 2.3.5 融合标签对PulA可溶性表达的影响 | 第33-34页 |
| 2.3.6 pET-22b(+)-PulA，pET-28a(+)-PulA表达效果检测 | 第34页 |
| 2.3.7 可溶性表达量上升机理分析 | 第34-35页 |
| 2.3.8 本底表达对PulA可溶性表达的影响 | 第35-36页 |
| 2.3.9 菌体生长不同阶段外源蛋白表达对PulA可溶性表达的影响 | 第36-37页 |
| 2.3.10 BL21(DE3)-pET-22b(+)-Pul A质粒不稳定性 | 第37页 |
| 2.3.11 Rosetta(DE3)对PulA可溶性表达的影响 | 第37-38页 |
| 2.3.12 BL21(DE3)-pET-28a(+)-PulA高密度发酵 | 第38-39页 |
| 2.4 小结 | 第39-41页 |
| 第三章 分子精简提高B. acidopullulyticus普鲁兰酶在E. coli中的可溶性表达水平和胞外分泌效率 | 第41-54页 |
| 3.1 引言 | 第41页 |
| 3.2 材料与方法 | 第41-44页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第41页 |
| 3.2.2 试剂与仪器 | 第41-42页 |
| 3.2.3 培养基和培养条件 | 第42页 |
| 3.2.4 重组质粒的构建与转化 | 第42页 |
| 3.2.5 重组菌的筛选与鉴定 | 第42-43页 |
| 3.2.6 重组蛋白的分离纯化 | 第43页 |
| 3.2.7 分析方法 | 第43页 |
| 3.2.8 最适pH及酸碱稳定性 | 第43页 |
| 3.2.9 最适温度及热稳定性 | 第43页 |
| 3.2.10动力学参数 | 第43页 |
| 3.2.11底物特异性及应用 | 第43-44页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第44-52页 |
| 3.3.1 截短突变体的设计 | 第44页 |
| 3.3.2 pelB-pET28a(+)的构建 | 第44-45页 |
| 3.3.3 重组菌的构建 | 第45-46页 |
| 3.3.4 表达效果检测 | 第46-47页 |
| 3.3.5 总酶活升高是可溶性表达量引起的升高 | 第47页 |
| 3.3.6 缺失CBM41的变体在信号肽的引导下分泌至胞外 | 第47-48页 |
| 3.3.7 细胞自溶引起胞外酶活上升 | 第48-49页 |
| 3.3.8 不同的普鲁兰酶变体引起可溶性表达量上的差异 | 第49页 |
| 3.3.9 不同的普鲁兰酶截短体引起分泌效率上的差异 | 第49-50页 |
| 3.3.10 最适pH及酸碱稳定性 | 第50页 |
| 3.3.11 最适温度及热稳定性 | 第50-51页 |
| 3.3.12 酶促动力学参数 | 第51页 |
| 3.3.13 底物特异性及应用 | 第51-52页 |
| 3.4 小结 | 第52-54页 |
| 第四章 计算机辅助理性改造提高B. acidopullulyticus普鲁兰酶的热稳定性 | 第54-68页 |
| 4.1 引言 | 第54页 |
| 4.2 材料与方法 | 第54-57页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第54页 |
| 4.2.2 试剂与仪器 | 第54页 |
| 4.2.3 培养基和培养条件 | 第54-55页 |
| 4.2.4 定点突变 | 第55页 |
| 4.2.5 重组蛋白的表达 | 第55-56页 |
| 4.2.6 热稳定性试验 | 第56页 |
| 4.2.7 普鲁兰酶酶活力测定 | 第56页 |
| 4.2.8 重组蛋白的纯化与定量 | 第56页 |
| 4.2.9 荧光发射光谱测定 | 第56页 |
| 4.2.10 特征参数的测定 | 第56-57页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第57-66页 |
| 4.3.1 突变位点的筛选 | 第57-59页 |
| 4.3.2 单点突变对普鲁兰酶热稳定性的影响 | 第59-61页 |
| 4.3.3 单点突变对比酶活及酶促动力学参数的影响 | 第61页 |
| 4.3.4 迭代突变对普鲁兰酶热稳定性的影响 | 第61-62页 |
| 4.3.5 迭代突变对比酶活及酶促动力学参数的影响 | 第62-63页 |
| 4.3.6 野生型普鲁兰酶及PulA-TS半衰期和Tm | 第63页 |
| 4.3.7 野生型普鲁兰酶及PulA-TS最适pH和温度 | 第63-64页 |
| 4.3.8 野生型普鲁兰酶及PulA-TS荧光光谱分析 | 第64-65页 |
| 4.3.9 四种理性设计方法对比分析 | 第65页 |
| 4.3.10 热稳定性的叠加性 | 第65页 |
| 4.3.11 突变体热稳定性机制初探 | 第65-66页 |
| 4.4 小结 | 第66-68页 |
| 第五章 嵌合蛋白技术提高B. acidopullulyticus普鲁兰酶的热稳定性 | 第68-77页 |
| 5.1 引言 | 第68页 |
| 5.2 材料与方法 | 第68-71页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第68页 |
| 5.2.2 试剂与仪器 | 第68页 |
| 5.2.3 培养基和培养条件 | 第68-69页 |
| 5.2.4 嵌合型基因的构建 | 第69-70页 |
| 5.2.5 分析方法 | 第70页 |
| 5.2.6 热稳定性试验 | 第70页 |
| 5.2.7 特征参数的测定 | 第70-71页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第71-76页 |
| 5.3.1 重组菌的构建 | 第71-72页 |
| 5.3.2 最适温度及热稳定性 | 第72-73页 |
| 5.3.3 热动力学稳定性 | 第73页 |
| 5.3.4 嵌合突变对菌体生长和酶催化性能的影响 | 第73-74页 |
| 5.3.5 嵌合突变对底物特异性的影响 | 第74页 |
| 5.3.6 嵌合突变对淀粉糖化应用性能的影响 | 第74-75页 |
| 5.3.7 嵌合突变对酶促动力学参数的影响 | 第75页 |
| 5.3.8 最适pH及酸碱稳定性 | 第75-76页 |
| 5.4 小结 | 第76-77页 |
| 主要结论与展望 | 第77-80页 |
| 主要结论 | 第77-78页 |
| 展望 | 第78-80页 |
| 论文主要创新点 | 第80-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 参考文献 | 第82-90页 |
| 附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第90页 |
