| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-16页 |
| 第1章 文献综述 | 第16-32页 |
| ·胰蛋白酶原和胰蛋白酶 | 第16-21页 |
| ·酶原与酶原激活 | 第16页 |
| ·胰蛋白酶原和胰蛋白酶简介 | 第16-17页 |
| ·胰蛋白酶的激活 | 第17页 |
| ·胰蛋白酶的作用机理 | 第17-18页 |
| ·胰蛋白酶的获取途径和研究进展 | 第18-20页 |
| ·胰蛋白酶的应用 | 第20-21页 |
| ·基因合成 | 第21-22页 |
| ·全基因合成的目的及意义 | 第21页 |
| ·全基因合成的研究现状以及各方法的优缺点 | 第21-22页 |
| ·基因表达的研究概况 | 第22-23页 |
| ·酵母表达系统 | 第23-26页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达体系的特点 | 第23-24页 |
| ·P.pastoris表达宿主菌株 | 第24页 |
| ·P.pastoris表达载体 | 第24-25页 |
| ·整合方式及转化方法 | 第25-26页 |
| ·P.pastoris表达系统应用前景和改进 | 第26页 |
| ·合成生物学 | 第26-31页 |
| ·Biobrick的基本结构 | 第28页 |
| ·Biobrick的组装方法 | 第28-30页 |
| ·构建串联基因的方法 | 第30页 |
| ·多拷贝表达策略的意义及局限性 | 第30-31页 |
| ·本文的研究目的与意义 | 第31-32页 |
| 第2章 实验材料与方法 | 第32-52页 |
| ·材料与仪器 | 第32-37页 |
| ·菌株 | 第32页 |
| ·质粒 | 第32-33页 |
| ·培养基 | 第33页 |
| ·试剂和酶 | 第33-34页 |
| ·仪器和相关实验设备 | 第34页 |
| ·实验主要常用溶液的配方及配制方法 | 第34-36页 |
| ·猪源胰蛋白酶全基因合成所用引物 | 第36-37页 |
| ·方法 | 第37-51页 |
| ·猪源胰蛋白酶全基因合成 | 第37-38页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳回收目的片段 | 第38-39页 |
| ·Muts处理目的DNA | 第39-40页 |
| ·T4DNA聚合酶处理PCR回收DNA片段 | 第40-41页 |
| ·连接反应 | 第41-42页 |
| ·质粒的双酶切处理 | 第42页 |
| ·制备化学法大肠杆菌感受态的流程 | 第42-43页 |
| ·大肠杆菌常规转化及快速转化的步骤 | 第43页 |
| ·碱裂解法抽提质粒 | 第43-44页 |
| ·构建P.pastoris重组表达载体 | 第44页 |
| ·制备P.pastoris GS115电转感受态细胞 | 第44-45页 |
| ·P.pastoris GS115的电击转化操作 | 第45页 |
| ·诱导外源基因在毕赤酵母中表达 | 第45-46页 |
| ·SDS-PAGE检测目的蛋白的表达 | 第46-47页 |
| ·Western Blotting检测目的蛋白的表达 | 第47-48页 |
| ·目的蛋白Trypsin的纯化 | 第48页 |
| ·胰蛋白酶的体外激活 | 第48页 |
| ·测定目的蛋白浓度 | 第48-50页 |
| ·胰蛋白酶的活性测定 | 第50-51页 |
| ·本文所用软件 | 第51-52页 |
| 第3章 结果与分析 | 第52-63页 |
| ·胰蛋白酶原的基因合成 | 第52-53页 |
| ·胰蛋白酶原毕赤酵母表达载体的构建 | 第53-55页 |
| ·pHBM905BDM-Try的毕赤酵母转化及转化子的鉴定 | 第55页 |
| ·Trypsin在毕赤酵母中的表达 | 第55-56页 |
| ·Western Blotting检测目的蛋白表达与否的结果 | 第56-57页 |
| ·1.4 拷贝胰蛋白酶蛋白表达及浓度 | 第57-59页 |
| ·比较1-4拷贝的Trypsin表达 | 第57页 |
| ·比较1-4拷贝的Trypsin蛋白浓度 | 第57-59页 |
| ·1.4 拷贝猪源Trypsin激活后的活性 | 第59-63页 |
| ·Trypsin最适pH测定 | 第60-61页 |
| ·猪源Trypsin最适温度测定 | 第61-62页 |
| ·猪源Trypsin热稳定性测定 | 第62-63页 |
| 第4章 讨论与展望 | 第63-65页 |
| ·讨论 | 第63-64页 |
| ·猪源胰蛋白酶基因的合成 | 第63页 |
| ·Biobrick和蛋白表达 | 第63页 |
| ·酶活的测定 | 第63-64页 |
| ·展望 | 第64-65页 |
| 结论 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-69页 |
| 致谢 | 第69页 |
