| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-12页 |
| 插图 | 第12-13页 |
| 附表清单 | 第13-15页 |
| 引言 | 第15-40页 |
| 1 A型流感病毒 | 第15-29页 |
| ·A型流感概述 | 第15-16页 |
| ·流感病毒抵抗力 | 第16-17页 |
| ·流感病毒结构、形态及化学组成 | 第17页 |
| ·流感病毒复制、变异及重组 | 第17-18页 |
| ·流感病毒历史上的爆发与流行 | 第18-20页 |
| ·流感病毒的抗原变异蛋白的结构与功能 | 第20-21页 |
| ·流感病毒抗原变异的分子基础 | 第21-23页 |
| ·流感病毒各蛋白与致病性的关系 | 第23-29页 |
| 2 H9N2型禽流感病毒 | 第29-32页 |
| ·H9N2亚型禽流感病毒的历史 | 第29-30页 |
| ·H9N2亚型禽流感病毒的分子演化 | 第30页 |
| ·H9N2亚型流感病毒在哺乳动物的分离及其“基因池”作用 | 第30-31页 |
| ·H9N2亚型禽流感病毒的增殖 | 第31-32页 |
| 3 流感病毒的疫苗研制 | 第32-33页 |
| ·抗原基因的选择 | 第32页 |
| ·流感疫苗的类型 | 第32-33页 |
| 4 反向遗传操作技术 | 第33-35页 |
| ·定义 | 第33-34页 |
| ·流感反向遗传技术 | 第34-35页 |
| ·流感病毒反向遗传技术应用 | 第35页 |
| 5 鸭坦布苏病毒 | 第35-37页 |
| ·鸭坦布苏病毒概述 | 第35页 |
| ·鸭坦布苏病毒的理化特性 | 第35-36页 |
| ·鸭坦布苏病毒基因组编码蛋白产物及E蛋白的生物学功能与特性 | 第36页 |
| ·鸭坦布苏病毒流行状况及致病特征 | 第36-37页 |
| 6 DNA疫苗研究进展 | 第37-39页 |
| 7 本实验研究的目的和意义 | 第39-40页 |
| 第一部分 H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及抗原性分析 | 第40-53页 |
| 1 材料与方法 | 第40-43页 |
| ·实验用H9N2亚型禽流感病毒 | 第40页 |
| ·SPF鸡胚、SPF鸡及其它 | 第40页 |
| ·H9N2亚型禽流感病毒的鉴定方法 | 第40-41页 |
| ·实验用H9N2亚型禽流感病毒的有限稀释法纯化及EID_(50)测定 | 第41页 |
| ·实验用H9N2亚型禽流感病毒阳性血清的制备 | 第41页 |
| ·H9N2亚型禽流感病毒的血凝抑制实验 | 第41页 |
| ·代表抗原性差别“r”值的计算 | 第41-42页 |
| ·H9N2亚型禽流感病毒的中和实验 | 第42页 |
| ·代表血清抑制性差别“R”值的计算 | 第42页 |
| ·H9N2亚型禽流感病毒接毒SPF鸡后病毒在感染鸡脏器的分布实验 | 第42-43页 |
| ·候选疫苗株Ck441(Ck/Shanghai/441/09)对SPF鸡的保护性实验 | 第43页 |
| 2 结果 | 第43-51页 |
| ·27株H9N2亚型禽流感病毒EIDso测定结果 | 第43-44页 |
| ·H9N2亚型禽流感病毒血凝抑制及“r”值计算结果 | 第44页 |
| ·H9N2亚型禽流感病毒中和实验结果 | 第44-49页 |
| ·SPF鸡接毒H9N2亚型禽流感病毒后脏器病毒的分离结果 | 第49-50页 |
| ·候选疫苗株Ck441灭活后对SPF鸡的保护性实验结果 | 第50-51页 |
| 3 讨论与小结 | 第51-53页 |
| 第二部分 H9N2亚型禽流感病毒对BALB/c小鼠的致病性研究 | 第53-59页 |
| 1 材料与方法 | 第53-54页 |
| ·实验用毒株 | 第53页 |
| ·实验动物及器械 | 第53页 |
| ·BALB/c小鼠实验操作过程 | 第53页 |
| ·BALB/c小鼠脏器的采集 | 第53页 |
| ·脏器病毒含量的测定 | 第53-54页 |
| 2 结果 | 第54-56页 |
| ·27株H9N2亚型禽流感病毒在BALB/c小鼠脏器的分离结果 | 第54-55页 |
| ·27株H9N2亚型禽流感病毒对BALB/c小鼠的致病性结果 | 第55-56页 |
| 3 讨论与小结 | 第56-59页 |
| 第三部分 H9N2亚型禽流感病毒分子进化分析 | 第59-87页 |
| 1 材料与方法 | 第59-61页 |
| ·材料 | 第59页 |
| ·主要试剂与仪器 | 第59页 |
| ·PCR及测序用引物 | 第59-60页 |
| ·病毒RNA的提取 | 第60-61页 |
| ·反转录 | 第61页 |
| ·目的片段的获得 | 第61页 |
| ·核苷酸序列的测定 | 第61页 |
| ·27株H9N2亚型禽流感病毒基因序列的拼接与分析 | 第61页 |
| 2 结果 | 第61-83页 |
| ·参考毒株及基因序列测定结果 | 第61-62页 |
| ·PB2基因比较分析结果 | 第62-64页 |
| ·PB1基因比较分析结果 | 第64页 |
| ·PA基因比较分析结果 | 第64-68页 |
| ·HA基因比较分析结果 | 第68-70页 |
| ·NP基因比较分析结果 | 第70-72页 |
| ·NA基因比较分析结果 | 第72-74页 |
| ·M基因比较分析结果 | 第74-75页 |
| ·NS基因比较分析结果 | 第75-82页 |
| ·27株H9N2亚型禽流感病毒8基因片段的归类结果 | 第82-83页 |
| 3 讨论与小结 | 第83-87页 |
| 第四部分 H9N2亚型重组流感病毒的拯救及其生物学特性的研究 | 第87-97页 |
| 1 材料与方法 | 第87-90页 |
| ·病毒及试剂 | 第87页 |
| ·SPF鸡胚和SPF鸡 | 第87页 |
| ·载体及构建质粒 | 第87页 |
| ·用于扩增HA和NA基因用引物 | 第87-88页 |
| ·HA和NA片段的扩增 | 第88页 |
| ·PCR产物的凝胶电泳纯化 | 第88页 |
| ·pBD载体和目的片段的酶切处理 | 第88页 |
| ·质粒pBD-441HA和pBD-441NA的构建 | 第88页 |
| ·H9N2亚型重组流感病毒的拯救过程 | 第88-89页 |
| ·拯救重组流感病毒的鉴定 | 第89页 |
| ·4株H9N2亚型重组流感病毒的拯救 | 第89页 |
| ·拯救重组流感病毒的增殖实验 | 第89页 |
| ·H9N2亚型拯救重组流感病毒的SPF鸡免疫及保护性实验 | 第89-90页 |
| ·疫苗候选病毒及其属性 | 第89-90页 |
| ·疫苗免疫与攻毒保护实验 | 第90页 |
| 2 结果 | 第90-91页 |
| ·pBD-441HA和pBD-441NA重组质粒构建 | 第90-91页 |
| ·4株H9N2亚型重组流感病毒的拯救结果 | 第91页 |
| ·拯救H9N2亚型重组流感病毒的鸡胚增殖实验结果 | 第91-92页 |
| ·病毒37℃鸡胚增殖结果 | 第91页 |
| ·病毒33℃鸡胚增殖结果 | 第91-92页 |
| ·拯救H9N2亚型重组病毒的细胞增殖实验结果 | 第92-94页 |
| ·无TPCK-trypsin的HA-2细胞增殖结果 | 第92-93页 |
| ·有TPCK-trypsin的HA-2细胞增殖结果 | 第93-94页 |
| ·SPF鸡免疫及保护性实验结果 | 第94-95页 |
| ·灭活疫苗免疫SPF鸡后不同时间激发抗体产生的含量结果 | 第94页 |
| ·喉头和泄殖腔病毒分离结果 | 第94页 |
| ·攻毒4d后实验鸡脏器的病毒分离结果 | 第94-95页 |
| 3 讨论与小结 | 第95-97页 |
| 第五部分 鸭坦布苏病毒对BALB/c小鼠及SPF鸡的致病性研究 | 第97-108页 |
| 1 材料与方法 | 第97-99页 |
| ·病毒 | 第97页 |
| ·实验动物 | 第97页 |
| ·鸭坦布苏病毒对BALB/c小鼠的致病性实验 | 第97-98页 |
| ·鸭坦布苏病毒不同接种途径感染BALB/c小鼠实验 | 第97页 |
| ·鸭坦布苏病毒脑内接种感染BALB/c小鼠实验 | 第97页 |
| ·鸭坦布苏病毒不同稀释度脑内接种感染BALB/c小鼠实验 | 第97-98页 |
| ·鸭坦布苏病毒脑内接种感染BALB/c小鼠后不同时间脏器病毒含量实验 | 第98页 |
| ·鸭坦布苏病毒对SPF鸡的致病性实验 | 第98-99页 |
| ·鸭坦布苏病毒对2周龄SPF鸡的致病性实验 | 第98-99页 |
| ·鸭坦布苏病毒对产蛋SPF鸡的致病性实验 | 第99页 |
| 2 结果 | 第99-105页 |
| ·BALB/c小鼠不同途径接种鸭坦布苏病毒的实验结果 | 第99-100页 |
| ·脏器病毒含量的测定结果 | 第99页 |
| ·小鼠体重变化 | 第99-100页 |
| ·BALB/c小鼠脑内接种鸭坦布苏病毒的结果 | 第100-101页 |
| ·脏器病毒含量的测定结果 | 第100-101页 |
| ·小鼠体重变化 | 第101页 |
| ·BALB/c小鼠脑内接种不同稀释度鸭坦布苏病毒后的体重变化 | 第101-102页 |
| ·BALB/c小鼠脑内接种鸭坦布苏病毒后不同时间脏器病毒含量结果 | 第102-103页 |
| ·鸭坦布苏病毒对2周龄SPF鸡致病性实验结果 | 第103-104页 |
| ·脏器病毒含量的测定结果 | 第103页 |
| ·2周龄SPF鸡的体重增长趋势 | 第103-104页 |
| ·鸭坦布苏病毒对产蛋SPF鸡致病性实验结果 | 第104-105页 |
| ·病毒含量的测定结果 | 第104页 |
| ·产蛋鸡产蛋量的变化 | 第104-105页 |
| 3 讨论与小结 | 第105-108页 |
| 第六部分 鸭坦布苏病毒DNA疫苗的初步研究 | 第108-115页 |
| 1 材料与方法 | 第108-110页 |
| ·病毒 | 第108页 |
| ·质粒、细胞及抗体 | 第108页 |
| ·主要试剂 | 第108页 |
| ·实验动物 | 第108页 |
| ·扩增E基因用引物的设计及合成 | 第108页 |
| ·E基因的密码子优化及合成 | 第108-109页 |
| ·野生型(Wild-type)和优化型(Opti-type)真核表达载体的构建 | 第109页 |
| ·野生型真核表达载体的构建 | 第109页 |
| ·优化型真核表达载体的构建 | 第109页 |
| ·间接免疫荧光(IFA)检测蛋白的表达 | 第109页 |
| ·Western blot检测蛋白的表达 | 第109-110页 |
| ·疫苗质粒对BALB/c小鼠的免疫 | 第110页 |
| ·间接ELISA检测BALB/c小鼠血清抗体 | 第110页 |
| 2 结果 | 第110-113页 |
| ·E基因的优化及合成结果 | 第110页 |
| ·重组DNA疫苗质粒的构建结果 | 第110-111页 |
| ·成功构建野生型DNA疫苗质粒pCAGGS-E | 第110-111页 |
| ·成功构建优化型DNA疫苗质粒pCAGGS-OptiE | 第111页 |
| ·间接免疫荧光(IFA)检测结果 | 第111-112页 |
| ·Western blot检测结果 | 第112页 |
| ·免疫BALB/c小鼠后不同时间分离血清中抗体的检测结果 | 第112-113页 |
| 3 讨论与小结 | 第113-115页 |
| 第七部分 全文结论 | 第115-116页 |
| 致谢 | 第116-117页 |
| 参考文献 | 第117-133页 |
| 附录 | 第133-134页 |
| 作者简介 | 第134页 |
