| 摘要 | 第1-9页 |
| 第一部分 文献综述 | 第9-23页 |
| ·漆酶 | 第9-13页 |
| ·漆酶的简介 | 第9页 |
| ·漆酶的研究进展 | 第9-13页 |
| ·漆酶的结构特征 | 第9-11页 |
| ·漆酶的理化性质 | 第11页 |
| ·漆酶基因的克隆和表达 | 第11-12页 |
| ·漆酶基因的体外诱变 | 第12-13页 |
| ·体外诱变 | 第13-19页 |
| ·体外诱变的研究进展 | 第13-18页 |
| ·不依赖PCR 的体外诱变方法 | 第13-14页 |
| ·依赖PCR 的体外诱变方法 | 第14-18页 |
| ·体外诱变的选择策略 | 第18-19页 |
| ·毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统 | 第19-23页 |
| ·Pichia pastoris 表达系统的研究概况 | 第19-21页 |
| ·宿主菌 | 第19页 |
| ·载体 | 第19-20页 |
| ·启动子 | 第20-21页 |
| ·载体的整合 | 第21页 |
| ·Pichia pastoris 表达系统的特点 | 第21-22页 |
| ·Pichia pastoris 表达系统的应用 | 第22页 |
| ·影响Pichia pastoris 中外源蛋白表达的因素 | 第22-23页 |
| ·外源基因的内在特性 | 第22页 |
| ·表达条件 | 第22-23页 |
| 第二部分 引言 | 第23-24页 |
| 第三部分 材料和方法 | 第24-34页 |
| ·材料 | 第24-26页 |
| ·菌株和质粒 | 第24-25页 |
| ·试剂和药品 | 第25页 |
| ·培养基 | 第25-26页 |
| ·仪器设备 | 第26页 |
| ·流程 | 第26-27页 |
| ·重组载体的构建 | 第26-27页 |
| ·重组克隆载体的构建 | 第26页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第26-27页 |
| ·漆酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第27页 |
| ·方法 | 第27-34页 |
| ·诱变PCR 体系的构建 | 第27-28页 |
| ·PCR 引物设计 | 第27页 |
| ·PCR 反应体系和循环条件 | 第27-28页 |
| ·PCR 产物的纯化 | 第28页 |
| ·重组载体的构建 | 第28-31页 |
| ·pMD19-lacM 的构建 | 第28-29页 |
| ·pHBM905AM 的构建 | 第29-31页 |
| ·质粒的提取 | 第31页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| ·使用CaC12 法制备大肠杆菌感受态细胞 | 第31页 |
| ·使用山梨醇制备毕赤酵母感受态细胞 | 第31-32页 |
| ·转化 | 第32页 |
| ·CaC12 法转化大肠杆菌 | 第32页 |
| ·电转化法转化毕赤酵母 | 第32页 |
| ·阳性转化子的筛选 | 第32页 |
| ·大肠杆菌阳性转化子的筛选 | 第32页 |
| ·重组毕赤酵母的PCR 鉴定 | 第32页 |
| ·毕赤酵母基因组DNA 的提取 | 第32-33页 |
| ·漆酶在毕赤酵母中的高密度诱导表达 | 第33页 |
| ·酶活力测定 | 第33页 |
| ·异丙醇沉降法 | 第33-34页 |
| 第四部分 结果与分析 | 第34-40页 |
| ·体外诱变结果 | 第34-37页 |
| ·易错PCR 结果 | 第34-35页 |
| ·易错PCR 条件的确定 | 第34页 |
| ·易错PCR 测序分析 | 第34-35页 |
| ·OE-PCR 结果 | 第35-37页 |
| ·OE-PCR 扩增产物 | 第35-36页 |
| ·OE-PCR 测序结果 | 第36-37页 |
| ·重组表达载体的构建及鉴定 | 第37-38页 |
| ·重组毕赤酵母的鉴定 | 第38页 |
| ·重组毕赤酵母的高密度诱导表达及SDS-PAGE 分析 | 第38-40页 |
| 第五部分 结论和讨论 | 第40-42页 |
| ·结论 | 第40页 |
| ·讨论 | 第40-42页 |
| ·易错PCR | 第40页 |
| ·表达载体的优势和通用性 | 第40-41页 |
| ·展望 | 第41-42页 |
| 参考文献 | 第42-49页 |
| 英文摘要 | 第49-50页 |
