| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-16页 |
| 第一章 绪论 | 第16-41页 |
| 1. 分子内分子伴侣 | 第16-25页 |
| ·概念 | 第16-17页 |
| ·IMC的分类 | 第17-20页 |
| ·第一类IMC | 第17-19页 |
| ·第二类IMC | 第19-20页 |
| ·IMC与蛋白质记忆 | 第20-21页 |
| ·IMC与人类疾病 | 第21页 |
| ·研究现状 | 第21-25页 |
| ·功能方面 | 第22-23页 |
| ·结构方面 | 第23-25页 |
| 2. 枯草杆菌蛋白酶 | 第25-34页 |
| ·晶体结构 | 第26-29页 |
| ·催化机制 | 第29-31页 |
| ·底物特异性 | 第31-32页 |
| ·枯草杆菌蛋白酶与前导肽 | 第32-34页 |
| 3. NK的概述 | 第34-35页 |
| 4. 溶血栓酶相关研究 | 第35-38页 |
| ·来源于微生物的溶血栓药物 | 第36-37页 |
| ·NK的体内效用 | 第37-38页 |
| 5. 生物信息学技术 | 第38-41页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第41-61页 |
| 第一节 实验材料 | 第41-43页 |
| 1. 分子克隆实验材料 | 第41页 |
| 2. 蛋白表达纯化和鉴定的实验材料 | 第41页 |
| 3. 酶动力学参数测定的实验材料 | 第41-42页 |
| 4. 大型仪器 | 第42-43页 |
| 第二节 实验方法 | 第43-61页 |
| 1. NK基因的获得与检测 | 第43-44页 |
| ·配置LB液体培养基 | 第43页 |
| ·配置LB固体培养基 | 第43页 |
| ·活化纳豆杆菌 | 第43-44页 |
| ·纳豆杆菌基因组的提取 | 第44页 |
| 2. PCR与产物回收 | 第44-48页 |
| ·纳豆杆菌基因组的PCR | 第44-45页 |
| ·重叠延伸PCR法引入定点突变 | 第45-47页 |
| ·PCR产物的回收 | 第47-48页 |
| 3. 载体质粒pET-26b(+)的提取 | 第48页 |
| 4. NK基因的酶切与回收 | 第48-49页 |
| ·NK基因的酶切 | 第49页 |
| ·NK基因酶切产物的回收 | 第49页 |
| 5. 载体质粒pET-26b(+)的酶切与回收 | 第49-50页 |
| ·载体质粒pET-26b(+)的酶切 | 第49页 |
| ·载体质粒pET-26b(+)的酶切后回收 | 第49-50页 |
| 6. NK基因与pET-26b(+)连接 | 第50页 |
| 7. 制备感受态细胞 | 第50-51页 |
| 8. 重组质粒的转化 | 第51页 |
| 9. 阳性转化子的鉴定 | 第51-52页 |
| ·菌落PCR | 第51-52页 |
| ·基因测序 | 第52页 |
| 10. NK的诱导表达与纯化 | 第52-54页 |
| ·NK的诱导表达 | 第52-53页 |
| ·NK的纯化 | 第53-54页 |
| 11. NK的鉴定 | 第54-55页 |
| 12. NK浓度的测定 | 第55-56页 |
| 13. 酶动力学参数测定 | 第56-57页 |
| 14. 荧光分光光度计收集结构信息 | 第57页 |
| 15. 圆二色谱仪获取结构信息 | 第57页 |
| 16. 快速稀释法蛋白复性 | 第57-58页 |
| 17. 生物信息学模拟与计算 | 第58-61页 |
| ·蛋白质结构的模拟 | 第58-59页 |
| ·分子动力学运用 | 第59-61页 |
| 第三章 实验结果和讨论 | 第61-125页 |
| 第一节 NK前导肽对于成熟肽折叠的作用 | 第61-77页 |
| 摘要 | 第61-62页 |
| 1. 研究背景 | 第62-65页 |
| 2. 实验结果与讨论 | 第65-75页 |
| ·纳豆杆菌基因组的提取 | 第65-66页 |
| ·NK全基因、NK成熟肽PCR和双酶切实验 | 第66-67页 |
| ·质粒载体pET-26b(+)的提取和双酶切 | 第67-68页 |
| ·NK基因和质粒载体pET-26b(+)的连接和转化 | 第68-73页 |
| ·菌落PCR | 第68-70页 |
| ·阳性转化子的质粒提取 | 第70-71页 |
| ·基因测序结果 | 第71-73页 |
| ·NK的诱导表达和纯化 | 第73-75页 |
| ·NK的诱导表达 | 第73页 |
| ·NK的纯化 | 第73-75页 |
| 3. 本节小结 | 第75-77页 |
| 第二节 NK前导肽的功能分析 | 第77-98页 |
| 摘要 | 第77-78页 |
| 1. 研究背景 | 第78-79页 |
| 2. 实验结果与讨论 | 第79-96页 |
| ·前导肽的同源比对 | 第79-80页 |
| ·定点突变 | 第80-84页 |
| ·突变体蛋白的表达、纯化和鉴定 | 第84页 |
| ·NK和突变体蛋白的结构分析 | 第84-87页 |
| ·NK成熟肽上残基的定点突变 | 第87-89页 |
| ·NK成熟肽突变体的诱导表达和纯化 | 第89-90页 |
| ·NK成熟肽突变体的结构分析 | 第90-92页 |
| ·生物信息学分析 | 第92-95页 |
| ·NK和突变体蛋白的酶动力学参数测定 | 第95-96页 |
| 3. 本节小结 | 第96-98页 |
| 第三节 确定NK前导肽上的重要氨基酸 | 第98-125页 |
| 摘要 | 第98-99页 |
| 1. 研究背景 | 第99-101页 |
| 2. 实验结果与讨论 | 第101-123页 |
| ·肽段缺失 | 第101-104页 |
| ·△N9和△N15的诱导表达与纯化 | 第104-106页 |
| ·△N9突变体的结构分析 | 第106-107页 |
| ·△N9突变体的酶动力学参数测定 | 第107-108页 |
| ·选择氨基酸位点 | 第108页 |
| ·定点突变 | 第108-114页 |
| ·单点突变体的蛋白表达与纯化 | 第114页 |
| ·单点突变体的结构分析 | 第114-118页 |
| ·单点突变体的酶动力学参数测定 | 第118页 |
| ·多点突变体的研究 | 第118-123页 |
| 3. 本节小结 | 第123-125页 |
| 参考文献 | 第125-138页 |
| 攻读期间的研究成果 | 第138-139页 |
| 致谢 | 第139页 |