| 综述部分 | 第1-40页 |
| 第一章 ES 细胞多能性维持与分化机理研究进展 | 第17-29页 |
| ·外源性信号 | 第17-20页 |
| ·LIF 及其信号转导系统对ES 细胞多能性的维持 | 第17-19页 |
| ·STAT3 对ES 细胞多能性的维持 | 第19页 |
| ·BMP 信号通路 | 第19-20页 |
| ·Wnt 信号通路 | 第20页 |
| ·内源性调节因子 | 第20-28页 |
| ·Oct4 对ES 细胞多能性的维持 | 第20-22页 |
| ·Nanog对ES 细胞多能性的维持 | 第22-25页 |
| ·nanog 基因编码一个特异的同源异型蛋白 | 第22-23页 |
| ·Nanog的表达 | 第23页 |
| ·由Ecat4/Nanog维持的LIF-非依赖性细胞自我更新 | 第23页 |
| ·Nanog缺失的ES 细胞失去多能性 | 第23-24页 |
| ·Nanog缺失胚胎不能形成外胚层 | 第24页 |
| ·Nanog维持ES 细胞自我更新能力机制 | 第24-25页 |
| ·Nanog与LIF、Stat3、Oct4 对ES 细胞多能性维持的关系 | 第25-28页 |
| ·LIF、Stat3、Oct4 对ES 细胞多能性维持相互关系 | 第25-26页 |
| ·Nanog与LIF、Stat3、Oct4 对ES 细胞多能性维持的比较 | 第26-28页 |
| ·展望 | 第28-29页 |
| 第二章 RNAi与干细胞研究 | 第29-40页 |
| ·RNAi的分子机理 | 第29-31页 |
| ·siRNA 生成 | 第30页 |
| ·RISC 的形成 | 第30-31页 |
| ·RNAi效应 | 第31页 |
| ·细胞中产生siRNA的方法 | 第31-34页 |
| ·长的dsRNA | 第31-32页 |
| ·siRNA | 第32页 |
| ·siRNA 库 | 第32-33页 |
| ·DNA 载体介导的RNAi | 第33-34页 |
| ·病毒载体介导的RNAi | 第34页 |
| ·慢病毒载体(Lentiviral vector, LV) | 第34页 |
| ·腺病毒载体(Adenoviral vector, AV) | 第34页 |
| ·腺病毒相关载体(Adenoviral-associated vectors, AAV) | 第34页 |
| ·干细胞中的RNAi现象 | 第34页 |
| ·RNAi在干细胞研究中的应用 | 第34-36页 |
| ·利用RNAi技术研究ES 细胞 | 第35-36页 |
| ·RNAi在造血干细胞(HSCs)中的研究 | 第36页 |
| ·研究干细胞RNAi效应的方法 | 第36-38页 |
| ·干细胞基因的标记 | 第36-37页 |
| ·dsRNA 的转染方法 | 第37页 |
| ·直接注射法 | 第37页 |
| ·脂质体介导的转染 | 第37页 |
| ·电穿孔法 | 第37页 |
| ·siRNA 干扰干细胞特异功能基因检测方法 | 第37-38页 |
| ·用RT-PCR 检测干细胞被干涉的目的m RNA的转录水平 | 第38页 |
| ·用Western-blot 分析被干涉基因的蛋白质表达水平 | 第38页 |
| ·检测干细胞生物学特性 | 第38页 |
| ·展望及存在的问题 | 第38-40页 |
| 研究部分 | 第40-83页 |
| 前言 | 第40-41页 |
| 第三章 小鼠ES 细胞nanog 基因的克隆及序列分析 | 第41-50页 |
| ·材料与方法 | 第41-47页 |
| ·材料 | 第41-42页 |
| ·细胞 | 第41页 |
| ·质粒与菌株 | 第41页 |
| ·酶及主要试剂 | 第41页 |
| ·仪器与设备 | 第41-42页 |
| ·溶液配制 | 第42页 |
| ·方法与步骤 | 第42-47页 |
| ·引物设计及合成 | 第42-43页 |
| ·细胞培养与总RNA 的提取 | 第43页 |
| ·RT-PCR | 第43-44页 |
| ·纯化回收DNA 片段 | 第44-45页 |
| ·纯化产物与pMD18-T Vector 连接 | 第45页 |
| ·新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法) | 第45页 |
| ·连接产物的转化 | 第45-46页 |
| ·重组质粒的提取 | 第46页 |
| ·重组质粒的酶切和PCR 鉴定及测序分析 | 第46-47页 |
| ·结果 | 第47-49页 |
| ·ES-D3 细胞在小鼠MEF 饲养层上的生长行为 | 第47页 |
| ·cDNA 合成及PCR | 第47页 |
| ·重组质粒的酶切和PCR 鉴定及测序分析 | 第47-49页 |
| ·讨论 | 第49页 |
| ·nanog 基因的克隆 | 第49页 |
| ·RNase 的存在与否及引物的设计是RT-PCR 成败的关键 | 第49页 |
| ·nanog 基因是一个高度保守的基因 | 第49页 |
| ·小结 | 第49-50页 |
| 第四章 小鼠ES 细胞在不同饲养层上培养nanog 基因的表达水平与生长行为 | 第50-59页 |
| ·材料与方法 | 第50-53页 |
| ·材料 | 第50-51页 |
| ·细胞 | 第50页 |
| ·质粒与菌株 | 第50页 |
| ·酶及主要试剂 | 第50-51页 |
| ·主要仪器与设备 | 第51页 |
| ·溶液配制 | 第51页 |
| ·方法 | 第51-53页 |
| ·引物设计及合成 | 第51页 |
| ·细胞培养与总RNA 的提取 | 第51页 |
| ·ES 细胞nanog 基因表达的半定量RT-PCR 检测 | 第51页 |
| ·不同饲养层细胞的制备 | 第51-52页 |
| ·AKP 染色 | 第52页 |
| ·ES-D3 细胞在不同饲养层上的传代培养 | 第52页 |
| ·不同饲养层上ES-D3 细胞克隆形成率的测定 | 第52-53页 |
| ·结果与分析 | 第53-57页 |
| ·cDNA 合成及RT-PCR 结果 | 第53-54页 |
| ·ES-D3 细胞在不同饲养层上的生长表现 | 第54-56页 |
| ·ES-D3 细胞在小鼠MEF 饲养层上的生长表现 | 第54页 |
| ·ES-D3 细胞在nBTSC 饲养层上的生长表现 | 第54页 |
| ·ES-D3 细胞在nRTSC 饲养层上的生长表现 | 第54-56页 |
| ·不同饲养层上ES-D3 细胞的克隆形成率 | 第56-57页 |
| ·讨论 | 第57-58页 |
| ·半定量RT-PCR 可以检测ES 细胞中Nanog表达水平 | 第57页 |
| ·MEF 饲养层有利于ES 细胞的生长扩增 | 第57-58页 |
| ·小结 | 第58-59页 |
| 第五章ES-D3 细胞nanog 基因干扰载体的构建及其干涉效果 | 第59-67页 |
| ·材料和方法 | 第59-62页 |
| ·材料 | 第59-60页 |
| ·细胞 | 第59页 |
| ·酶及主要试剂 | 第59页 |
| ·仪器与设备 | 第59-60页 |
| ·溶液配制 | 第60页 |
| ·方法 | 第60-62页 |
| ·nanog 基因siRNA表达载体的构建 | 第60-61页 |
| ·nanog 基因siRNA表达载体的酶切鉴定 | 第61页 |
| ·ES-D3 细胞转染和培养 | 第61页 |
| ·RT-PCR 引物的设计及合成 | 第61页 |
| ·ES-D3 细胞nanog 基因RNA 干涉的半定量RT-PCR 检测 | 第61-62页 |
| ·ES 细胞的生长特性及AKP 染色 | 第62页 |
| ·结果和分析 | 第62-64页 |
| ·nanog 基因siRNA表达载体的酶切鉴定 | 第62页 |
| ·ES-D3 细胞转染效率估测 | 第62-63页 |
| ·RNAi效果的半定量RT-PCR 检测 | 第63-64页 |
| ·干涉后ES-D3 细胞的生长和特性 | 第64页 |
| ·讨论 | 第64-66页 |
| ·RNAi技术是研究基因组功能的重要工具 | 第64-65页 |
| ·直接用转染液重悬消化的细胞可以提高转染效率 | 第65页 |
| ·nanog 基因暂时性干扰的ES 细胞仍保持未分化状态和多能性 | 第65-66页 |
| ·小结 | 第66-67页 |
| 第六章 以RNAi技术研究nanog 基因对ES 细胞多能性的维持 | 第67-76页 |
| ·材料和方法 | 第67-69页 |
| ·材料 | 第67-68页 |
| ·质粒与细胞株 | 第67页 |
| ·主要试剂 | 第67页 |
| ·主要仪器 | 第67-68页 |
| ·溶液配制 | 第68页 |
| ·方法 | 第68-69页 |
| ·稳定干扰载体pGsi305 的构建 | 第68页 |
| ·质粒DNA 的大量制备及其纯化按文献方法进行 | 第68页 |
| ·稳定干扰载体pGsi305 转染ES-D3 细胞及筛选 | 第68-69页 |
| ·ES-D3 细胞nanog 基因RNA 干涉的半定量RT-PCR 检测 | 第69页 |
| ·干扰ES-D3 细胞形态观察及AKP、SSEA-1、c-kit、Oct4 染色 | 第69页 |
| ·ES-D3 细胞和小鼠MEF 细胞抗G418 最佳浓度筛选 | 第69页 |
| ·结果与分析 | 第69-74页 |
| ·重组稳定干扰载体的酶切鉴定 | 第69-70页 |
| ·阳性转染ES-D3 细胞的效率检测 | 第70页 |
| ·RNAi效果的半定量RT-PCR 检测 | 第70-71页 |
| ·干涉后ES-D3 细胞的生长和特性 | 第71-73页 |
| ·ES-D3 细胞和小鼠MEF 细胞抗G418 最佳浓度筛选 | 第73-74页 |
| ·讨论 | 第74-75页 |
| ·pGsi305 重组干扰载体的构建 | 第74页 |
| ·稳定干扰细胞的筛选 | 第74页 |
| ·nanog 基因敲除的ES 细胞丧失其多能性的特征 | 第74-75页 |
| ·小结 | 第75-76页 |
| 第七章 小鼠ES 细胞nanog 基因真核表达载体的构建 | 第76-83页 |
| ·材料与方法 | 第76-79页 |
| ·材料 | 第76-77页 |
| ·细胞 | 第76页 |
| ·质粒与菌株 | 第76页 |
| ·酶及主要试剂 | 第76页 |
| ·仪器与设备 | 第76页 |
| ·溶液配制 | 第76-77页 |
| ·方法与步骤 | 第77-79页 |
| ·引物设计及合成 | 第77页 |
| ·细胞培养与总RNA 的提取 | 第77页 |
| ·重组载体pNA992 的构建及鉴定 | 第77页 |
| ·重组表达载体pG-bnanog的构建及鉴定 | 第77-79页 |
| ·结果 | 第79-80页 |
| ·克隆片段的RT-PCR 及重组质粒的鉴定 | 第79页 |
| ·表达引物的PCR 扩增及重组质粒的鉴定 | 第79-80页 |
| ·重组表达载体pG-bnanog的鉴定 | 第80页 |
| ·讨论 | 第80-82页 |
| ·重组表达质粒构建采用pMD-18T 载体 | 第80-81页 |
| ·表达引物的设计 | 第81页 |
| ·表达载体的选择 | 第81-82页 |
| ·小结 | 第82-83页 |
| 结论 | 第83-84页 |
| 创新点 | 第84-85页 |
| 进一步研究的课题 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-94页 |
| 致谢 | 第94-95页 |
| 作者简介 | 第95-96页 |
