| 摘要 | 第6-8页 |
| abstract | 第8-10页 |
| 第一章 引言 | 第17-23页 |
| 1.1 弓形虫及弓形虫病概况 | 第17页 |
| 1.2 分泌蛋白 | 第17-19页 |
| 1.2.1 棒状体蛋白 | 第18页 |
| 1.2.2 微线体蛋白 | 第18-19页 |
| 1.2.3 致密颗粒蛋白 | 第19页 |
| 1.3 弓形虫表面抗原 | 第19-22页 |
| 1.3.1 弓形虫表面抗原SAG1(P30) | 第19-20页 |
| 1.3.2 弓形虫表面抗原SAG2(P22) | 第20页 |
| 1.3.3 弓形虫表面抗原SAG3(P43) | 第20页 |
| 1.3.4 SAG1 相关序列蛋白家族(SRS蛋白家族) | 第20-22页 |
| 1.4 弓形虫疫苗研究进展 | 第22页 |
| 1.5 选题的目的和意义 | 第22-23页 |
| 第二章 刚地弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列SRS47D的生物信息学分析 | 第23-35页 |
| 2.1 材料和方法 | 第23-25页 |
| 2.1.1 蛋白及编码基因序列的获取 | 第23页 |
| 2.1.2 SRS47D蛋白序列理化参数分析 | 第23-24页 |
| 2.1.3 SRS47D蛋白质亲水性和疏水性分析 | 第24页 |
| 2.1.4 蛋白信号肽和亚细胞定位预测 | 第24页 |
| 2.1.5 翻译后蛋白修饰位点预测 | 第24页 |
| 2.1.6 二级结构及表面可及性等参数预测 | 第24页 |
| 2.1.7 卷曲螺旋预测 | 第24-25页 |
| 2.1.8 跨膜结构域预测 | 第25页 |
| 2.1.9 蛋白质的三级结构预测和比对 | 第25页 |
| 2.1.10 T、B细胞抗原表位预测 | 第25页 |
| 2.1.11 SRS47D相互作用网络预测 | 第25页 |
| 2.2 结果 | 第25-33页 |
| 2.2.1 蛋白质序列理化参数分析 | 第25-26页 |
| 2.2.2 亲/疏水性分析 | 第26页 |
| 2.2.3 蛋白信号肽和亚细胞定位预测 | 第26-27页 |
| 2.2.4 翻译后蛋白修饰位点预测 | 第27页 |
| 2.2.5 二级结构及表面可及性等参数分析 | 第27-29页 |
| 2.2.6 卷曲螺旋分析 | 第29-30页 |
| 2.2.7 跨膜结构域分析 | 第30页 |
| 2.2.8 蛋白质的三级结构预测 | 第30-31页 |
| 2.2.9 T、B细胞抗原表位预测 | 第31-33页 |
| 2.2.10 SRS47D相互作用网络分析 | 第33页 |
| 2.3 讨论 | 第33-35页 |
| 第三章 弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列SRS47D基因的原核表达及蛋白定位研究 | 第35-55页 |
| 3.1 实验材料 | 第36-39页 |
| 3.1.1 虫株、菌株、质粒、实验动物 | 第36页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第36-37页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第37-38页 |
| 3.1.4 主要溶液的配制 | 第38-39页 |
| 3.2 实验方法 | 第39-47页 |
| 3.2.1 RH株弓形虫在小鼠腹腔连续传代培养 | 第39页 |
| 3.2.2 RH株弓形虫速殖子的纯化 | 第39页 |
| 3.2.3 引物的设计与合成 | 第39-40页 |
| 3.2.4 弓形虫RH株总RNA的提取和纯化 | 第40页 |
| 3.2.5 逆转录合成c DNA | 第40-41页 |
| 3.2.6 刚地弓形虫SRS47D基因的PCR扩增 | 第41页 |
| 3.2.7 刚地弓形虫SRS47D基因的纯化回收 | 第41-42页 |
| 3.2.8 重组质粒的构建及鉴定 | 第42-43页 |
| 3.2.9 重组质粒pColdⅠ-SRS47D的大量提取 | 第43页 |
| 3.2.10 重组质粒pColdⅠ-SRS47D的酶切鉴定 | 第43页 |
| 3.2.11 重组蛋白的表达及纯化 | 第43-45页 |
| 3.2.12 纯化蛋白的Western blot分析 | 第45页 |
| 3.2.13 兔抗重组SRS47D血清的制备 | 第45-46页 |
| 3.2.14 间接ELISA检测抗血清效价 | 第46页 |
| 3.2.15 间接免疫荧光检测SRS47D蛋白在弓形虫速殖子中的定位 | 第46页 |
| 3.2.16 兔抗rSRS47D多克隆抗体IgG纯化 | 第46页 |
| 3.2.17 兔抗rSRS47D多克隆抗体体外阻断弓形虫入侵Vero细胞实验 | 第46-47页 |
| 3.3 结果 | 第47-53页 |
| 3.3.1 SRS47D基因的扩增和重组质粒pColdⅠ-SRS47D的鉴定 | 第47-48页 |
| 3.3.2 目的蛋白的表达及纯化 | 第48-49页 |
| 3.3.3 纯化蛋白的Western blot分析 | 第49-50页 |
| 3.3.4 间接ELISA检测抗血清效价 | 第50-52页 |
| 3.3.5 间接免疫荧光检测SRS47D蛋白在弓形虫速殖子中的定位 | 第52页 |
| 3.3.6 兔抗rSRS47D多克隆抗体体外阻断弓形虫入侵Vero细胞效果 | 第52-53页 |
| 3.4 讨论 | 第53-55页 |
| 第四章 弓形虫SRS47D和SRS37A互作模式的双分子荧光互补分析 | 第55-71页 |
| 4.1 材料与方法 | 第55-59页 |
| 4.1.1 虫株、菌株、质粒、细胞 | 第55-56页 |
| 4.1.2 试剂 | 第56页 |
| 4.1.3 SRS47D、SRS37A、SRS23 蛋白的保守结构域和功能域预测 | 第56页 |
| 4.1.4 引物的设计与合成 | 第56-57页 |
| 4.1.5 SRS47D、SRS37A、SRS23、SRS47-D1、SRS47D-D2、SRS37A-D1、SRS37A-D2基因的RT-PCR扩增 | 第57-58页 |
| 4.1.6 SRS47D、SRS37A、SRS23 基因真核表达质粒的构建及鉴定 | 第58页 |
| 4.1.7 双分子荧光互补实验 | 第58-59页 |
| 4.1.8 SRS47D与 SRS37A蛋白在弓形虫速殖子中免疫荧光共定位检测 | 第59页 |
| 4.2 结果 | 第59-68页 |
| 4.2.1 SRS47D、SRS37A、SRS23 蛋白的保守结构域和功能域 | 第59-60页 |
| 4.2.2 SRS47D、SRS37A、SRS23、SRS47D-D1、SRS47D-D2、SRS37A-D1、SRS37A-D2基因的扩增 | 第60-61页 |
| 4.2.3 含SRS47D、SRS37A、SRS23、SRS47D-D1、SRS47D-D2、SRS37A-D1、SRS37A-D2 基因真核表达质粒的酶切鉴定 | 第61-64页 |
| 4.2.4 双分子荧光互补实验分组 | 第64-65页 |
| 4.2.5 SRS47D与SRS37A和SRS23 蛋白之间的相互作用 | 第65-66页 |
| 4.2.6 SRS47D和SRS37A在RH弓形虫速殖子中荧光共定位 | 第66-67页 |
| 4.2.7 SRS47D结构域与SRS37A结构域之间的相互作用 | 第67-68页 |
| 4.3 讨论 | 第68-71页 |
| 第五章 rSRS47D和rSRS37A及联合免疫对小鼠弓形虫感染的保护效果评价 | 第71-88页 |
| 5.1 实验材料 | 第71-72页 |
| 5.1.1 虫种、蛋白、细胞、小鼠 | 第71-72页 |
| 5.1.2 试剂 | 第72页 |
| 5.1.3 溶液 | 第72页 |
| 5.2 试验方法 | 第72-76页 |
| 5.2.1 RH株弓形虫小鼠腹腔连续传代培养 | 第72页 |
| 5.2.2 RH株弓形虫速殖子的纯化 | 第72页 |
| 5.2.3 实验动物分组、免疫、感染 | 第72-74页 |
| 5.2.4 血清抗体效价的ELISA测定 | 第74页 |
| 5.2.5 鼠抗rSRS47D、rSRS37A、rSRS47D+rSRS37A多克隆抗体体外阻断弓形虫入侵Vero实验 | 第74页 |
| 5.2.6 脾脏淋巴细胞制备 | 第74-75页 |
| 5.2.7 T淋巴细胞亚型鉴定 | 第75页 |
| 5.2.8 脾淋巴细胞增值实验 | 第75页 |
| 5.2.9 细胞因子检测 | 第75页 |
| 5.2.10 小鼠弓形虫RH株人工感染试验 | 第75-76页 |
| 5.2.11 统计分析 | 第76页 |
| 5.3 实验结果 | 第76-85页 |
| 5.3.1 血清抗体效价的ELISA检测 | 第76页 |
| 5.3.2 鼠抗rSRS47D、rSRS37A、rSRS47D+rSRS37A多克隆抗体体外阻断弓形虫入侵Vero细胞效果 | 第76-77页 |
| 5.3.3 脾淋巴细胞增殖 | 第77-78页 |
| 5.3.4 淋巴细胞亚型检测 | 第78-80页 |
| 5.3.5 细胞因子检测 | 第80-84页 |
| 5.3.6 小鼠弓形虫RH株人工感染试验 | 第84-85页 |
| 5.4 讨论 | 第85-88页 |
| 第六章 全文结论 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-96页 |
| 附录 | 第96-97页 |
| 致谢 | 第97-99页 |
| 作者简历 | 第99页 |
