| 摘要 | 第12-13页 |
| Abstract | 第13页 |
| 1 前言 | 第14-40页 |
| 1.1 手足口病 | 第14-17页 |
| 1.1.1 手足口病的简介 | 第14页 |
| 1.1.2 手足口病的流行病学 | 第14-15页 |
| 1.1.3 手足口病的病原学 | 第15-16页 |
| 1.1.4 手足口病的治疗原则和预防方法 | 第16-17页 |
| 1.2 肠道病毒71型(EV71) | 第17-21页 |
| 1.2.1 EV71简介 | 第17页 |
| 1.2.2 EV71的颗粒和基因组结构 | 第17-19页 |
| 1.2.3 EV71的生活史 | 第19-21页 |
| 1.2.4 EV71的致病机制 | 第21页 |
| 1.3 EV71的2A蛋白酶 | 第21-25页 |
| 1.3.1 EV71 2A蛋白酶的简介 | 第21-22页 |
| 1.3.2 EV71 2A蛋白酶的生物学功能 | 第22页 |
| 1.3.3 同源2A蛋白酶的结构及生物学研究现状 | 第22-24页 |
| 1.3.4 靶向2A蛋白酶抑制剂 | 第24-25页 |
| 1.4 结构生物学和蛋白晶体学 | 第25-31页 |
| 1.4.1 结构生物学简介及研究进展 | 第25-26页 |
| 1.4.2 蛋白结晶学原理 | 第26页 |
| 1.4.3 X-射线晶体学解析蛋白质结构的基本流程 | 第26-31页 |
| 1.4.3.1 蛋白生物信息学分析 | 第27页 |
| 1.4.3.2 基因克隆 | 第27-28页 |
| 1.4.3.3 蛋白的表达和纯化 | 第28页 |
| 1.4.3.4 蛋白质结晶 | 第28-29页 |
| 1.4.3.5 晶体优化 | 第29-30页 |
| 1.4.3.6 获得复合物晶体主要方法 | 第30页 |
| 1.4.3.7 晶体结构的解析 | 第30-31页 |
| 1.5 计算机辅助药物设计 | 第31-38页 |
| 1.5.1 基于分子对接的虚拟筛选 | 第32-35页 |
| 1.5.1.1 虚拟筛选 | 第32-33页 |
| 1.5.1.2 分子对接 | 第33页 |
| 1.5.1.3 基于分子对接的虚拟筛选方法 | 第33-35页 |
| 1.5.2 基于片段的药物发现 | 第35-38页 |
| 1.6 NMR技术在药物筛选中的应用 | 第38-39页 |
| 1.7 研究目的和意义 | 第39-40页 |
| 2 实验材料和方法 | 第40-62页 |
| 2.1 实验材料 | 第40-42页 |
| 2.1.1 主要仪器 | 第40-41页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第41-42页 |
| 2.1.3 质粒和菌株 | 第42页 |
| 2.2 实验相关试剂的配制 | 第42-46页 |
| 2.2.1 培养基和抗生素的配制 | 第42-43页 |
| 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳试剂 | 第43页 |
| 2.2.3 SDS-PAGE电泳试剂 | 第43-44页 |
| 2.2.4 质粒提取及DNA片段回收相关试剂 | 第44-45页 |
| 2.2.5 感受态制备相关试剂 | 第45页 |
| 2.2.6 蛋白纯化相关试剂 | 第45-46页 |
| 2.2.7 蛋白结晶相关试剂 | 第46页 |
| 2.3 实验方法 | 第46-62页 |
| 2.3.1 目的基因的克隆 | 第46-49页 |
| 2.3.1.1 引物设计 | 第47页 |
| 2.3.1.2 PCR扩增 | 第47-48页 |
| 2.3.1.3 PCR产物回收 | 第48-49页 |
| 2.3.2 表达质粒的构建 | 第49-51页 |
| 2.3.2.1 质粒的提取 | 第49-50页 |
| 2.3.2.2 载体双酶切 | 第50页 |
| 2.3.2.3 LIC法构建表达质粒 | 第50-51页 |
| 2.3.3 表达质粒导入宿主细胞 | 第51-53页 |
| 2.3.3.1 感受态细胞的制备 | 第51-52页 |
| 2.3.3.2 质粒转化 | 第52页 |
| 2.3.3.3 DpnⅠ消化 | 第52-53页 |
| 2.3.4 定点突变 | 第53-55页 |
| 2.3.5 目的蛋白的表达 | 第55-56页 |
| 2.3.6 目的蛋白的纯化 | 第56-57页 |
| 2.3.6.1 Ni柱亲和层析 | 第56页 |
| 2.3.6.2 凝胶过滤层析 | 第56-57页 |
| 2.3.7 目的蛋白结晶 | 第57页 |
| 2.3.8 衍射数据的收集和处理 | 第57-58页 |
| 2.3.8.1 衍射数据的收集 | 第57-58页 |
| 2.3.8.2 结构解析 | 第58页 |
| 2.3.9 蛋白质与小分子的相互作用 | 第58-62页 |
| 2.3.9.1 Soaking方法 | 第58页 |
| 2.3.9.2 核磁共振方法 | 第58-59页 |
| 2.3.9.3 饱和转移差谱(STD)方法 | 第59-60页 |
| 2.3.9.4 生物膜干涉技术BLI | 第60-62页 |
| 3 实验结果 | 第62-86页 |
| 3.1 EV71 2A(C110A)的结构学研究 | 第62-81页 |
| 3.1.1 蛋白酶目的基因的扩增和回收 | 第62页 |
| 3.1.2 载体的酶切和回收 | 第62-63页 |
| 3.1.3 LIC法构建表达质粒 | 第63-64页 |
| 3.1.4 目的蛋白的表达和纯化 | 第64-66页 |
| 3.1.5 蛋白晶体结构 | 第66-70页 |
| 3.1.6 虚拟筛选苗头化合物的相互作用检测 | 第70-76页 |
| 3.1.7 筛选片段小分子与蛋白的复合物结构 | 第76-78页 |
| 3.1.8 STD方法验证相互作用 | 第78-79页 |
| 3.1.9 BLI实验方法验证相互作用 | 第79-81页 |
| 3.2 EV71 2A活性蛋白的表达和纯化 | 第81-86页 |
| 3.2.1 基因克隆与载体构建 | 第81-82页 |
| 3.2.2 蛋白的表达和纯化 | 第82-86页 |
| 4 讨论与展望 | 第86-88页 |
| 参考文献 | 第88-95页 |
| 致谢 | 第95-96页 |