| 摘要 | 第9-11页 |
| ABSTRACT | 第11-13页 |
| 缩略词与中英对照 | 第14-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-30页 |
| 1.1 柑橘黄化脉明病毒(Citrusyellowveinclearingvirus,CYVCV)研究进展 | 第16-19页 |
| 1.1.1 发生与分布 | 第16页 |
| 1.1.2 分类地位及分子生物学特性 | 第16-18页 |
| 1.1.3 寄主范围及传播途径 | 第18页 |
| 1.1.4 检测方法 | 第18-19页 |
| 1.2 柑橘叶斑驳病毒(Citrusleafblotchvirus,CLBV)研究进展 | 第19-21页 |
| 1.2.1 发生与分布 | 第19-20页 |
| 1.2.2 分类地位及生物学特性 | 第20-21页 |
| 1.2.3 寄主范围及传播途径 | 第21页 |
| 1.2.4 检测方法 | 第21页 |
| 1.2.5 CLBV作为病毒载体的应用 | 第21页 |
| 1.3 植物病毒侵染性克隆的构建及其应用研究进展 | 第21-26页 |
| 1.3.1 植物病毒侵染性克隆的构建 | 第22页 |
| 1.3.2 侵染性克隆在大肠杆菌中的稳定性 | 第22-24页 |
| 1.3.3 侵染性克隆的接种方法 | 第24页 |
| 1.3.4 侵染性克隆的应用 | 第24-26页 |
| 1.3.5 展望 | 第26页 |
| 1.4 TAR克隆技术研究进展 | 第26-30页 |
| 1.4.1 TAR克隆技术的发展 | 第26-27页 |
| 1.4.2 TAR克隆技术的应用 | 第27-28页 |
| 1.4.3 展望 | 第28-30页 |
| 第二章 引言 | 第30-32页 |
| 2.1 研究目的及意义 | 第30页 |
| 2.2 技术路线 | 第30-31页 |
| 2.3 主要研究内容 | 第31-32页 |
| 2.3.1 病毒侵染性克隆的快速构建体系 | 第31页 |
| 2.3.2 CYVCV侵染性克隆构建 | 第31页 |
| 2.3.3 CLBV侵染性克隆构建及初步应用 | 第31-32页 |
| 第三章 病毒侵染性克隆的快速构建体系 | 第32-48页 |
| 3.1 材料、仪器与试剂 | 第32-34页 |
| 3.1.1 材料 | 第32页 |
| 3.1.2 主要试剂及试剂配制 | 第32-33页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第33-34页 |
| 3.2 试验方法 | 第34-41页 |
| 3.2.1 引物设计 | 第34页 |
| 3.2.2 三元穿梭载体pCY的构建 | 第34-36页 |
| 3.2.3 PVX全长cDNA的扩增 | 第36-37页 |
| 3.2.4 pCY质粒抽提 | 第37页 |
| 3.2.5 pCY质粒酶切 | 第37页 |
| 3.2.6 TAR克隆构建PVX全长cDNA侵染性克隆 | 第37-38页 |
| 3.2.7 酵母菌落PCR检测 | 第38页 |
| 3.2.8 酵母质粒提取 | 第38-39页 |
| 3.2.9 酵母质粒转化农杆菌和大肠杆菌 | 第39页 |
| 3.2.10 农杆菌介导接种 | 第39-40页 |
| 3.2.11 PVX全长cDNA侵染性克隆的鉴定 | 第40-41页 |
| 3.3 结果与分析 | 第41-45页 |
| 3.3.1 三元穿梭载体pCY的构建 | 第41-43页 |
| 3.3.2 PVX全长cDNA的扩增 | 第43页 |
| 3.3.3 pCY质粒酶切 | 第43-44页 |
| 3.3.4 TAR克隆构建PVX全长cDNA侵染性克隆 | 第44页 |
| 3.3.5 酵母菌落PCR检测 | 第44页 |
| 3.3.6 PVX全长cDNA侵染性克隆的鉴定 | 第44-45页 |
| 3.4 讨论 | 第45-48页 |
| 第四章 CYVCV侵染性克隆构建 | 第48-64页 |
| 4.1 材料、仪器与试剂 | 第48-49页 |
| 4.1.1 材料 | 第48页 |
| 4.1.2 主要试剂及试剂配制 | 第48页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第48-49页 |
| 4.2 试验方法 | 第49-55页 |
| 4.2.1 柑橘叶片总RNA提取 | 第49页 |
| 4.2.2 CYVCV5′RACE扩增与克隆鉴定 | 第49-51页 |
| 4.2.3 引物设计 | 第51-52页 |
| 4.2.4 CYVCV全长cDNA扩增 | 第52-53页 |
| 4.2.5 pCY质粒酶切 | 第53页 |
| 4.2.6 TAR克隆构建CYVCV全长cDNA侵染性克隆 | 第53页 |
| 4.2.7 酵母菌落PCR检测 | 第53页 |
| 4.2.8 酵母质粒提取(PCY-CYVCV)与转化农杆菌、大肠杆菌 | 第53-54页 |
| 4.2.9 pCY-CYVCV的酶切验证与序列分析 | 第54页 |
| 4.2.10 农杆菌介导接种 | 第54页 |
| 4.2.11 体外转录与摩擦接种 | 第54-55页 |
| 4.3 结果与分析 | 第55-62页 |
| 4.3.1 柑橘叶片总RNA提取 | 第55页 |
| 4.3.2 CYVCV5′RACE扩增与克隆鉴定 | 第55-57页 |
| 4.3.3 CYVCV全长cDNA扩增 | 第57页 |
| 4.3.4 TAR克隆构建CYVCV全长cDNA侵染性克隆 | 第57页 |
| 4.3.5 酵母菌落PCR检测 | 第57-58页 |
| 4.3.6 pCY-CYVCV全长cDNA克隆的酶切鉴定 | 第58页 |
| 4.3.7 CYVCV全基因组序列分析 | 第58-60页 |
| 4.3.8 CYVCV全长cDNA侵染性克隆的鉴定 | 第60-61页 |
| 4.3.9 体外转录 | 第61-62页 |
| 4.4 讨论 | 第62-64页 |
| 4.4.1 CYVCV全长cDNA的一步法RT-PCR体系的建立 | 第62页 |
| 4.4.2 CYVCV全长cDNA侵染性克隆的构建及分析 | 第62-64页 |
| 第五章 CLBV侵染性克隆构建及初步应用 | 第64-82页 |
| 5.1 材料、仪器与试剂 | 第64-65页 |
| 5.1.1 材料 | 第64页 |
| 5.1.2 主要试剂及试剂配制 | 第64-65页 |
| 5.1.3 主要仪器 | 第65页 |
| 5.2 试验方法 | 第65-72页 |
| 5.2.1 柑橘叶片总RNA的提取 | 第65页 |
| 5.2.2 引物设计 | 第65-66页 |
| 5.2.3 RT-PCR扩增 | 第66-67页 |
| 5.2.4 pCY质粒酶切 | 第67页 |
| 5.2.5 TAR克隆构建CLBV全长cDNA侵染性克隆 | 第67页 |
| 5.2.6 酵母菌落PCR检测 | 第67-68页 |
| 5.2.7 酵母质粒(pCY-CLBV)提取与转化农杆菌、大肠杆菌 | 第68页 |
| 5.2.8 PCY-CLBV的酶切验证与序列分析 | 第68页 |
| 5.2.9 农杆菌介导接种本生烟 | 第68页 |
| 5.2.10 RT-PCR检测CLBV的侵染性克隆 | 第68-69页 |
| 5.2.11 NorthernBlot检测CLBV的侵染性克隆 | 第69-70页 |
| 5.2.12 病毒表达载体pCLBV的构建 | 第70-72页 |
| 5.3 结果与分析 | 第72-80页 |
| 5.3.1 柑橘叶片总RNA提取 | 第72页 |
| 5.3.2 CLBV全长cDNA分段RT-PCR扩增 | 第72-73页 |
| 5.3.3 TAR克隆构建CLBV全长cDNA侵染性克隆 | 第73-74页 |
| 5.3.4 酵母菌落PCR检测 | 第74页 |
| 5.3.5 pCY-CLBV酶切验证 | 第74-75页 |
| 5.3.7 CLBV全基因组序列分析 | 第75-76页 |
| 5.3.8 CLBV全长cDNA侵染性克隆的鉴定 | 第76-77页 |
| 5.3.9 病毒表达载体pCLBV的构建 | 第77-80页 |
| 5.4 讨论 | 第80-82页 |
| 5.4.1 利用TAR克隆构建CLBV的侵染性克隆 | 第80页 |
| 5.4.2 病毒表达载体pCLBV的构建与表达情况 | 第80-82页 |
| 第六章 主要结论、创新点和展望 | 第82-84页 |
| 6.1 主要结论 | 第82页 |
| 6.1.1 建立了基于三元穿梭载体pCY的酵母重组克隆体系 | 第82页 |
| 6.1.2 利用TAR克隆体系成功构建了CYVCV全长cDNA侵染性克隆 | 第82页 |
| 6.1.3 利用TAR克隆体系成功构建了CLBV全长cDNA侵染性克隆 | 第82页 |
| 6.2 创新点 | 第82-83页 |
| 6.3 展望 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-92页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文及参加科研项目 | 第92-94页 |
| 致谢 | 第94-95页 |
