| 致谢 | 第6-8页 |
| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACTS | 第10-11页 |
| 1 文献综述及研究意义 | 第16-51页 |
| 1.1 遗传改良农作物简介 | 第16-19页 |
| 1.2 苏云金芽孢杆菌(Bt)概况 | 第19-24页 |
| 1.2.1 苏云金芽孢杆菌的发现与应用 | 第19-21页 |
| 1.2.2 Bt杀虫毒素的分类与特征 | 第21-22页 |
| 1.2.3 Bt毒素的分类、命名与多样性 | 第22-24页 |
| 1.3 Cry毒素:结构与机理 | 第24-32页 |
| 1.3.1 Cry毒素的典型结构:三结构域 | 第24-27页 |
| 1.3.2 Cry毒素的受体与作用机理 | 第27-32页 |
| 1.3.2.1 Cry蛋白的受体:APN,ALP,Cadherin和ABC transporter | 第28-30页 |
| 1.3.2.2 Cry毒素的作用机理 | 第30-32页 |
| 1.4 Vip毒素 | 第32-37页 |
| 1.4.1 Vip3蛋白:功能与结构 | 第32-33页 |
| 1.4.2 Vip3蛋白:作用机理和杀虫活性 | 第33-36页 |
| 1.4.3 vip3A基因遗传改良的策略 | 第36-37页 |
| 1.5 昆虫对Bt蛋白的抗性:作用机理及治理策略 | 第37-48页 |
| 1.5.1 昆虫抗性产生的机理(一): 蛋白无法激活或被隔离 | 第38-39页 |
| 1.5.2 昆虫抗性产生的机理(二): 中肠受体的变化 | 第39-45页 |
| 1.5.3 昆虫抗性的治理策略 | 第45-48页 |
| 1.6 研究意义及技术路线 | 第48-51页 |
| 2 材料与方法 | 第51-68页 |
| 2.1 实验材料 | 第51-52页 |
| 2.1.1 菌株 | 第51页 |
| 2.1.2 受体植物 | 第51页 |
| 2.1.3 质粒载体 | 第51页 |
| 2.1.4 工具酶类 | 第51-52页 |
| 2.1.5 试剂盒类及其他 | 第52页 |
| 2.2 本研究应用的分子生物学实验方法 | 第52-64页 |
| 2.2.1 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR) | 第52页 |
| 2.2.2 质粒小量抽提 | 第52-53页 |
| 2.2.3 限制性内切酶消化DNA(酶切反应) | 第53页 |
| 2.2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳及纯化回收 | 第53-54页 |
| 2.2.5 DNA片段的连接 | 第54-55页 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 | 第55页 |
| 2.2.6.1 感受态细胞的制备 | 第55页 |
| 2.2.6.2 大肠杆菌转化 | 第55页 |
| 2.2.7 根癌农杆菌感受态细胞的制备与转化 | 第55-56页 |
| 2.2.7.1 感受态细胞的制备 | 第56页 |
| 2.2.7.2 根癌农杆菌转化 | 第56页 |
| 2.2.8 植物基因组的提取(CTAB法) | 第56-57页 |
| 2.2.9 植物总RNA的提取 | 第57-58页 |
| 2.2.10 反转录:cDNA第一链的合成 | 第58-59页 |
| 2.2.11 DNA印迹(Southern Blot) | 第59-61页 |
| 2.2.12 蛋白质的检测与分析 | 第61-64页 |
| 2.2.12.1 蛋白质样品的提取 | 第61页 |
| 2.2.12.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis,PAGE) | 第61-62页 |
| 2.2.12.3 蛋白质免疫印迹分析(Western Blot) | 第62-63页 |
| 2.2.12.4 蛋白质定量: 酶联免疫吸附反应(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA) | 第63-64页 |
| 2.3 本研究采用的玉米转基因方法——农杆菌介导法 | 第64-65页 |
| 2.3.1 玉米幼胚的获取 | 第64页 |
| 2.3.2 农杆菌与玉米幼胚的共培养 | 第64页 |
| 2.3.3 诱导愈伤组织和筛选 | 第64页 |
| 2.3.4 转基因玉米的再生与培养 | 第64-65页 |
| 2.4 本研究采用的水稻转基因方法——农杆菌介导法 | 第65-66页 |
| 2.4.1 水稻成熟胚愈伤组织的诱导 | 第65页 |
| 2.4.2 农杆菌与水稻的共培养 | 第65-66页 |
| 2.4.3 抗性愈伤组织的筛选 | 第66页 |
| 2.4.4 转基因植株的再生与培养 | 第66页 |
| 2.5 本研究采用的昆虫生物测定方法 | 第66-68页 |
| 2.5.1 原核表达蛋白的生物测定 | 第66-67页 |
| 2.5.2 转基因植物的生物测定 | 第67-68页 |
| 3 抗虫融合基因的改造、载体构建与原核表达分析 | 第68-86页 |
| 3.1 融合基因的拼接与修饰 | 第68-73页 |
| 3.1.1 cry1Ab、vip3da基因及linker的获得 | 第68-69页 |
| 3.1.2 拼接与修饰 | 第69-73页 |
| 3.1.2.1 将cry1Ab和vip3da拼接成融合基因 | 第69-73页 |
| 3.2 转化载体的构建 | 第73-78页 |
| 3.2.1 载体优化及抗草甘膦基因表达框的构建 | 第73-76页 |
| 3.2.2 融合基因表达框的构建 | 第76-78页 |
| 3.3 抗虫融合蛋白的原核表达分析 | 第78-86页 |
| 3.3.1 原核表达载体的构建 | 第78-79页 |
| 3.3.2 融合蛋白的表达与定量 | 第79-81页 |
| 3.3.3 原核表达融合蛋白的生物活性测定 | 第81-86页 |
| 4 Cry-Vip融合策略在转基因玉米中的研究 | 第86-120页 |
| 4.1 转基因玉米的获得 | 第86页 |
| 4.2 转基因玉米的分子特征鉴定 | 第86-101页 |
| 4.2.1 PCR鉴定 | 第86-89页 |
| 4.2.2 转基因玉米中外源蛋白的定量:ELISA | 第89-91页 |
| 4.2.3 外源基因在转基因玉米中的表达:Western Blot | 第91-93页 |
| 4.2.4 外源基因在玉米基因组中的插入位点及边界序列鉴定 | 第93-99页 |
| 4.2.5 外源基因拷贝数鉴定:Southern Blot | 第99-101页 |
| 4.3 玉米转化株系SL21和SL34的综合分析 | 第101-118页 |
| 4.3.1 SL34 | 第101-108页 |
| 4.3.2 SL21 | 第108-113页 |
| 4.3.3 转基因玉米中抗虫基因的转录水平分析 | 第113-116页 |
| 4.3.4 转基因玉米的抗虫性能分析 | 第116-118页 |
| 4.4 小结:Cry-Vip融合策略在转基因玉米上的应用前景 | 第118-120页 |
| 5 Cry-Vip融合策略在转基因水稻中的研究 | 第120-136页 |
| 5.1 转基因水稻的获得 | 第120页 |
| 5.2 转基因水稻的分子特征鉴定 | 第120-131页 |
| 5.2.1 PCR鉴定 | 第121页 |
| 5.2.2 转基因水稻中外源蛋白的定量:ELISA | 第121-123页 |
| 5.2.3 外源基因在转基因水稻中的表达分析 | 第123-125页 |
| 5.2.4 外源基因在水稻基因组中的插入位点及边界序列鉴定 | 第125-128页 |
| 5.2.5 外源基因拷贝数鉴定:Southern Blot | 第128-130页 |
| 5.2.6 转基因水稻中抗虫基因的转录水平分析 | 第130-131页 |
| 5.3 转基因水稻的抗虫性能分析 | 第131-133页 |
| 5.4 小结: Cry-Vip融合策略在转基因水稻上的应用前景 | 第133-136页 |
| 6 总结与讨论 | 第136-140页 |
| 参考文献 | 第140-149页 |
| 附录: 本研究使用的溶液和培养基配方 | 第149-159页 |
