| 致谢 | 第5-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 1 研究背景 | 第20-65页 |
| 1.1 双生病毒的发生与危害 | 第20-22页 |
| 1.2 菜豆金色花叶病毒属病毒的分类地位及基本特性 | 第22-26页 |
| 1.3 菜豆金色花叶病毒属病毒伴随卫星DNAβ的研究进展 | 第26-32页 |
| 1.3.1 DNAβ的基因组结构 | 第26页 |
| 1.3.2 DNAβ参与病毒症状的诱导 | 第26-28页 |
| 1.3.3 DNAβ参与PTGS的抑制 | 第28-29页 |
| 1.3.4 DNAβ参与TGS的抑制 | 第29-30页 |
| 1.3.5 DNAβ参与病毒的运动 | 第30-31页 |
| 1.3.6 DNAβ参与寄主防卫反应的抑制 | 第31-32页 |
| 1.4 RNA沉默与双生病毒 | 第32-63页 |
| 1.4.1 RNA沉默的基本机理 | 第33-36页 |
| 1.4.2 参与抗病毒的RNA沉默途径中的核心蛋白 | 第36-44页 |
| 1.4.3 病毒诱发的RNA沉默与编码的RNA沉默抑制子 | 第44-51页 |
| 1.4.4 双生病毒诱发的RNA沉默 | 第51-55页 |
| 1.4.5 双生病毒编码的RNA沉默抑制子 | 第55-63页 |
| 1.5 本项目的研究目的和意义 | 第63-65页 |
| 2 实验方法 | 第65-91页 |
| 2.1 常规DNA克隆技术 | 第65-72页 |
| 2.1.1 PCR技术 | 第65-68页 |
| 2.1.2 PCR产物的纯化 | 第68页 |
| 2.1.3 载体的去磷酸化 | 第68页 |
| 2.1.4 连接 | 第68页 |
| 2.1.5 感受态细胞的制备 | 第68-70页 |
| 2.1.6 转化 | 第70页 |
| 2.1.7 菌落PCR筛选 | 第70-71页 |
| 2.1.8 重组质粒的提取 | 第71页 |
| 2.1.9 重组克隆的酶切鉴定 | 第71-72页 |
| 2.1.10 重组克隆的测序鉴定 | 第72页 |
| 2.2 重组质粒导入根癌农杆菌及农杆菌介导的植物接种 | 第72-73页 |
| 2.2.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备 | 第72页 |
| 2.2.2 重组质粒电击转化根癌农杆菌 | 第72-73页 |
| 2.2.3 农杆菌的浸润及接种 | 第73页 |
| 2.3 烟草的遗传转化 | 第73-75页 |
| 2.3.1 农杆菌的培养 | 第73-74页 |
| 2.3.2 烟草叶片的准备 | 第74页 |
| 2.3.3 预培养 | 第74页 |
| 2.3.4 农杆菌的侵染 | 第74页 |
| 2.3.5 分化培养 | 第74-75页 |
| 2.3.6 生根培养 | 第75页 |
| 2.4 植物总DNA提取以及Southern blot分析 | 第75-80页 |
| 2.4.1 大量抽提植物DNA的方法(CTAB法) | 第75-77页 |
| 2.4.2 小量抽提植物DNA的方法(CTAB法) | 第77页 |
| 2.4.3 小量抽提植物DNA的方法(试剂盒法) | 第77-78页 |
| 2.4.4 Southern印迹分析 | 第78-80页 |
| 2.5 植物总RNA小量提取、RT-PCR及RT-qPCR | 第80-82页 |
| 2.5.1 植物总RNA的小量提取步骤 | 第80-81页 |
| 2.5.2 反转录RT-PCR及RT-qPCR | 第81-82页 |
| 2.6 Northern印迹杂交 | 第82-86页 |
| 2.6.1 mRNA的Northern印迹杂交 | 第82-84页 |
| 2.6.2 小RNA的分离及Northern blot | 第84-86页 |
| 2.7 原核蛋白的表达及纯化 | 第86-88页 |
| 2.7.1 原核蛋白的表达 | 第86-87页 |
| 2.7.2 原核蛋白的纯化 | 第87-88页 |
| 2.8 植物总蛋白的提取、蛋白的SDS-PAGE及Western blot杂交 | 第88-89页 |
| 2.8.1 植物总蛋白的提取 | 第88页 |
| 2.8.2 蛋白的SDS-PAGE及Western blot杂交 | 第88-89页 |
| 2.9 亲和层析法纯化血清中的抗体 | 第89-91页 |
| 2.9.1 亲和柱的制备 | 第89-90页 |
| 2.9.2 抗体的纯化 | 第90-91页 |
| 3 βC1上调本氏烟钙调素类似蛋白rgs-CaMs的研究 | 第91-113页 |
| 3.1 材料与方法 | 第92-102页 |
| 3.1.1 材料 | 第92-93页 |
| 3.1.2 载体构建 | 第93-94页 |
| 3.1.3 农杆菌介导的浸润及病毒的接种 | 第94-95页 |
| 3.1.4 转基因阳性植株的筛选与病毒侵染性的检测 | 第95页 |
| 3.1.5 烟草Microarray基因表达谱的制备及分析 | 第95页 |
| 3.1.6 本氏烟转录组的高通量测序 | 第95-96页 |
| 3.1.7 Northern blot及RT-qPCR的分析 | 第96页 |
| 3.1.8 酵母转化 | 第96-102页 |
| 3.2 结果与分析 | 第102-111页 |
| 3.2.1 卫星DNAβ编码的βC1蛋白能够诱导rgs-CaMs的表达 | 第102-104页 |
| 3.2.2 rgs-CaMs基因的序列分析 | 第104-105页 |
| 3.2.3 Nbrgs-CaM亚细胞定位及组织特异性表达分析 | 第105-108页 |
| 3.2.4 Nbrgs-CaM的转录激活作用分析 | 第108-110页 |
| 3.2.5 Nbrgs-CaM蛋白的纯化与多克隆抗体的制备 | 第110-111页 |
| 3.3 讨论 | 第111-113页 |
| 4 βC1与rgs-CaMs抑制RNA沉默的特性研究 | 第113-132页 |
| 4.1 材料与方法 | 第113-120页 |
| 4.1.1 材料 | 第113-114页 |
| 4.1.2 载体构建 | 第114-115页 |
| 4.1.3 农杆菌介导的浸润及接种 | 第115页 |
| 4.1.4 GFP荧光记录与样品采集 | 第115页 |
| 4.1.5 检测病毒侵染性及VIGS的效率 | 第115-116页 |
| 4.1.6 植物RNA与蛋白的杂交分析 | 第116-120页 |
| 4.2 结果与分析 | 第120-129页 |
| 4.2.1 Rgs-CaMs是内源的PTGS抑制子 | 第120-121页 |
| 4.2.2 Nbrgs-CaM能够抑制双生病毒诱导的内源基因沉默 | 第121-123页 |
| 4.2.3 Nbrgs-CaM与βC1抑制PTGS中dsRNA的产生 | 第123-125页 |
| 4.2.4 Ntrgs-CaM与Slrgs-CaM抑制PTGS中dsRNA的产生 | 第125-127页 |
| 4.2.5 Nbrgs-CaM对于βc1的RNA沉默抑制活性是必需的 | 第127-129页 |
| 4.3 讨论 | 第129-132页 |
| 5 Rgs-CaMs对βC1介导双生病毒致病性的研究 | 第132-149页 |
| 5.1 材料与方法 | 第132-140页 |
| 5.1.1 材料 | 第132-133页 |
| 5.1.2 载体构建 | 第133-134页 |
| 5.1.3 农杆菌介导的浸润及病毒的接种 | 第134页 |
| 5.1.4 转基因阳性植株的筛选 | 第134-135页 |
| 5.1.5 病毒侵染性的检测 | 第135页 |
| 5.1.6 Northern blot及RT-qPCR的分析 | 第135页 |
| 5.1.7 Western blot分析 | 第135页 |
| 5.1.8 Southern blot分析 | 第135-140页 |
| 5.2 结果与分析 | 第140-147页 |
| 5.2.1 Nbrgs-CaM转基因植株的表型分析 | 第140-141页 |
| 5.2.2 Nbrgs-CaM在βC1症状诱导中的功能 | 第141-142页 |
| 5.2.3 Rgs-CaMs对双生病毒致病性的影响 | 第142-145页 |
| 5.2.4 Nbrgs-CaM对CMV致病性的影响 | 第145-147页 |
| 5.4 讨论 | 第147-149页 |
| 6 Nbrgs-CaM抑制RDR6介导的RNA沉默对双生病毒的抗性分析 | 第149-168页 |
| 6.1 材料与方法 | 第149-156页 |
| 6.1.1 材料 | 第149-150页 |
| 6.1.2 pPVX-Nbrgs-CaM载体构建 | 第150页 |
| 6.1.3 农杆菌介导的浸润及接种 | 第150页 |
| 6.1.4 GFP荧光记录与样品采集 | 第150-151页 |
| 6.1.5 病毒侵染性及VIGS效率的检测 | 第151页 |
| 6.1.6 RNA与蛋白的杂交分析 | 第151-156页 |
| 6.2 结果与分析 | 第156-167页 |
| 6.2.1 Nbrgs-CaM与βC1能够抑制NbRDR6的表达 | 第156-158页 |
| 6.2.2 Nbrgs-CaM对于βC1抑制NbRDR6是必需的 | 第158页 |
| 6.2.3 Nbrgs-CaM过表达与NbRDR6沉默的植株均能抑制S-PTGS | 第158-161页 |
| 6.2.4 NbRDR6参与双生病毒诱导的RNA沉默 | 第161-163页 |
| 6.2.5 NbRDR6介导抗双生病毒的RNA沉默反应 | 第163-164页 |
| 6.2.6 RDR6限制了双生病毒的寄主范围 | 第164-167页 |
| 6.3 讨论 | 第167-168页 |
| 7 Nbrgs-CaM影响SGS3介导的RNA沉默对双生病毒的抗性分析 | 第168-201页 |
| 7.1 材料与方法 | 第169-177页 |
| 7.1.1 材料 | 第169-170页 |
| 7.1.2 载体的构建 | 第170-171页 |
| 7.1.3 农杆菌介导的浸润及接种 | 第171-172页 |
| 7.1.4 GFP荧光记录与样品采集 | 第172页 |
| 7.1.5 检测病毒侵染性及VIGS的效率 | 第172页 |
| 7.1.6 Western blot分析NbSGS3蛋白的积累 | 第172-177页 |
| 7.2 结果与分析 | 第177-199页 |
| 7.2.1 NbSGS3序列分析及组织表达特异性 | 第177-178页 |
| 7.2.2 NbSGS3对于局部及系统S-PTGS的产生是必需的 | 第178-180页 |
| 7.2.3 NbSGS3对于系统沉默的维持是必需的 | 第180-181页 |
| 7.2.4 NbSGS3协同NbRDR6参与对双生病毒的抗性 | 第181-190页 |
| 7.2.5 Nbrgs-CaM能够与NbSGS3互作 | 第190-193页 |
| 7.2.6 NbSGS3的亚细胞定位分析 | 第193-195页 |
| 7.2.7 Nbrgs-CaM与NbSGS3能够相互影响细胞定位 | 第195-197页 |
| 7.2.8 Nbrgs-CaM下调NbSGS3蛋白的积累 | 第197-199页 |
| 7.3 讨论 | 第199-201页 |
| 8 βC1上调Nbrgs-CaM的机理分析 | 第201-223页 |
| 8.1 材料与方法 | 第201-208页 |
| 8.1.1 材料 | 第201-202页 |
| 8.1.2 载体的构建 | 第202-203页 |
| 8.1.3 农杆菌的浸润与样品采集 | 第203页 |
| 8.1.4 GUS活性测定与染色分析 | 第203-204页 |
| 8.1.5 GFP紫外拍照、蛋白检测与活性分析 | 第204页 |
| 8.1.6 甲基化相关实验的方法 | 第204-205页 |
| 8.1.7 病毒侵染率及转基因植株的阳性筛选 | 第205-208页 |
| 8.2 结果与分析 | 第208-222页 |
| 8.2.1 βC1的核定位突变体对Nbrgs-CaM表达的影响 | 第208-210页 |
| 8.2.2 Nbrgs-CaM启动子的克隆 | 第210-211页 |
| 8.2.3 Nbrgs-CaM启动子瞬时表达的活性分析 | 第211-213页 |
| 8.2.4 Nbrgs-CaM启动子的甲基化分析 | 第213-215页 |
| 8.2.5 pC1对Nbrgs-CaM启动子甲基化的影响 | 第215-216页 |
| 8.2.6 Nbrgs-CaM启动子转基因的活性分析 | 第216-218页 |
| 8.2.7 双生病毒侵染对Nbrgs-CaM转基因启动子活性的影响 | 第218-222页 |
| 8.3 讨论 | 第222-223页 |
| 9 全文小结与研究展望 | 第223-225页 |
| 9.1 全文小结 | 第223-224页 |
| 9.2 研究展望 | 第224-225页 |
| 附文1 印度绿豆黄化花叶病毒编码AC5基因功能的鉴定与分析 | 第225-255页 |
| 1.1 材料与方法 | 第225-235页 |
| 1.1.1 材料 | 第225-226页 |
| 1.1.2 MYMIV侵染性克隆的构建 | 第226-227页 |
| 1.1.3 MYMIV AC5突变体侵染性克隆的构建 | 第227页 |
| 1.1.4 重组载体的构建 | 第227-228页 |
| 1.1.5 农杆菌的接种或者浸润 | 第228-229页 |
| 1.1.6 抑制子鉴定实验 | 第229页 |
| 1.1.7 荧光观察、拍照并采集样品 | 第229-230页 |
| 1.1.9 DAB染色分析 | 第230-235页 |
| 1.2 结果与分析 | 第235-252页 |
| 1.2.1 AC5的序列分析及转录起始位点的确定 | 第235-237页 |
| 1.2.2 AC5突变对MYMIV致病性的影响 | 第237-239页 |
| 1.2.3 PVX表达AC5蛋白的致病性分析 | 第239-240页 |
| 1.2.4 AC5基因的PTGS抑制子活性分析 | 第240-244页 |
| 1.2.5 AC5基因的TGS抑制子活性分析 | 第244-246页 |
| 1.2.6 AC5抑制PTGS的结构域的鉴定 | 第246-247页 |
| 1.2.7 AC5抑制TGS及致病性相关的结构域的鉴定 | 第247-249页 |
| 1.2.8 AC5转基因植株的分析 | 第249-250页 |
| 1.2.9 AC5转基因植株对MYMIV-AC5m毒力的影响 | 第250-252页 |
| 1.3 讨论 | 第252-255页 |
| 附文2 番茄黄化曲叶病毒编码蛋白的致病性分析与TGS抑制子的鉴定 | 第255-266页 |
| 2.1 材料与方法 | 第255-259页 |
| 2.1.1 材料 | 第255-256页 |
| 2.1.2 载体构建与农杆菌浸润 | 第256页 |
| 2.1.3 拍照、样品采集与Western blot实验 | 第256-259页 |
| 2.2 结果与分析 | 第259-264页 |
| 2.2.1 番茄黄化曲叶病毒编码蛋白的致病性分析 | 第259-261页 |
| 2.2.2 番茄黄化曲叶病毒抑制TGS能力的分析 | 第261页 |
| 2.2.3 番茄黄化曲叶病毒编码TGS抑制子的鉴定 | 第261-264页 |
| 2.3 讨论 | 第264-266页 |
| 附文3 双生病毒在酵母系统中的复制机理探讨 | 第266-292页 |
| 3.1 材料与方法 | 第267-279页 |
| 3.1.1 材料 | 第267页 |
| 3.1.2 载体构建 | 第267页 |
| 3.1.3 酵母转化 | 第267-279页 |
| 3.2 结果与分析 | 第279-289页 |
| 3.2.1 鉴定可在酵母中复制的双生病毒 | 第279-281页 |
| 3.2.2 酵母复制相关交体对MYMIV复制的影响 | 第281-283页 |
| 3.2.3 酵母突变体对Y194复制的影响 | 第283-284页 |
| 3.2.4 Y194复制模式的分析 | 第284-286页 |
| 3.2.5 Y194复制原点类似元件的鉴定 | 第286-288页 |
| 3.2.6 Y194中CEN元件的鉴定 | 第288-289页 |
| 3.3 讨论 | 第289-292页 |
| 参考文献 | 第292-312页 |
| 附录A 本论文所用缩写词及中英文对照 | 第312-315页 |
| 附录B 本论文所用病毒缩写及中英文对照 | 第315-317页 |
| 附录C 常用缓冲液及培养基配方 | 第317-325页 |
| 作者简历及攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第325页 |
